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小麦Na~+/H~+逆转运蛋白的功能分析

作　者: 许海霞
导　师: 崔党群
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦 Na~+/H~+逆转运蛋白 TaSOS1 TaNHX2 质膜 液泡膜 离子转运活性
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目前盐胁迫已成为重要的非生物胁迫之一,土壤盐渍化对农业的危害是一个全球性的问题。小麦属淡土植物,其生长受到盐胁迫的抑制,盐害直接影响着小麦生产的发展。在盐胁迫条件下,Na+会通过非特异性离子通道进入细胞内,为了减轻Na+的危害,植物细胞通过质膜上的Na+/H+逆转运蛋白把Na+排出体外,或者通过液泡膜上的Na+/H+逆转运蛋白把Na+区域化至液泡中,从而维持胞质内正常的离子均衡。本研究借助酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变体,对小麦质膜Na+/H+逆转运蛋白TaSOS1和小麦液泡膜Na+/H+逆转运蛋白TaNHX2的耐盐性和其Na+/H+离子转运活性进行了分析。主要研究结果如下：1.分子信息学的分析表明TaSOS1与拟南芥AtSOS1和水稻OsSOS1的同源性高,TaSOS1可能与AtSOS1和OsSOS1的功能相同,为质膜Na+/H+逆转运蛋白,可以将细胞内过多的Na+排出体外。用荧光定量PCR的方法研究了TaSOS1的表达模式,分析了TaSOS1对NaCl盐胁迫、4℃低温胁迫、ABA离子胁迫和PEG6000干旱胁迫的表达情况。在正常条件下,小麦根中TaSOSl的mRNA表达量高于叶中的表达量；盐胁迫处理下,根中TaSOS1的特异性表达显著,呈现出上调表达,而叶中的TaSOS1在不同时间内的表达量差异不明显,表明TaSOS1在根中的表达丰度较高,与组织特异性有关,在根中受盐胁迫特异性表达。TaSOS1的表达不受ABA、PEG和低温的影响,为非ABA依赖途径。2.构建酵母表达载体pYPGE15-TaSOS1,用PEG/LiAc化学转化方法转入酵母中,通过酵母功能互补验证证实了TaSOS1可以部分互补酵母盐敏感突变体AXT3K的耐盐功能,能够在AP+80 mM NaCl的培养基上生长,而转空载体的对照则表现为致死。在20 mM NaCl胁迫之下,转TaSOS1基因的酵母细胞体内Na＋含量比对照中显著降低,证明了TaSOS1具有Na+转运功能,可以把Na+排出体外,从而降低细胞内Na+的浓度。3.采用两相法提纯了转TaSOSl基因和转空载体酵母细胞的质膜,根据H+-ATPase对各专一性抑制剂的敏感性来鉴定质膜纯度。Na3VO4对H+-ATPase活性敏感性最大,H+-ATPase活性降低了60%,而NaN3、KNO3、Na2MoO4对H+-ATPase活性与对照相比基本无影响,说明膜微囊制剂未被线粒体、液泡膜及磷酸酶污染,从酵母细胞中分离到的质膜纯度较高,去除了大部分杂膜。4.用荧光猝灭的方法检测了质膜微囊内外H+梯度的变化,以达到稳态时每毫克膜蛋白所产生的荧光猝灭值计算跨膜H+梯度,进而检测转基因酵母细胞质膜的Na+/H+转运活性。结果表明含有TaSOS1基因的酵母细胞质膜,其Na+/H+转运活性要高于对照,Na+/H+转运活性的差异与NaCl的耐性和离子含量的结果相吻合,证明了TaSOS1蛋白具有Na+/H+转运活性,这种离子转运功能在耐盐过程中发挥着重要作用。5.克隆了小麦液泡膜Na+/H+逆转运蛋白TaNHX2, TaNHX2与AtNHX1和AtNHX2同源性最高,说明了TaNHX2可能与小麦的耐盐有关。Western blot结果表明,pYES2-TaNHX2可以在酵母中很好的表达。酵母功能互补实验表明TaNHX2可以互补AXT3K对盐的敏感性,能在含有30 mM和60 mM NaCl的AP培养基上正常生长,但其耐盐性没有达到野生型酵母的耐盐性,同时TaNHX2可以提高转基因酵母的耐钾性,这说明TaNHX2不仅有转运Na+的功能,同时也有转运K+的功能。研究了在NaCl胁迫条件下酵母细胞中的Na+、K+离子含量,在20 mM NaCl胁迫条件下,含有TaNHX2的酵母细胞中Na+含量与对照相比没有显著差异,相反,K+含量差异达到极显著水平。这可能是TaNHX2的耐盐性不单是由于其转运Na+,更重要的是由于K+在细胞内的积累导致耐盐性增强,这是目前报道的液泡膜NHX蛋白中第一个具有耐钾功能的蛋白。6.为了验证TaNHX2的cation/H+离子交换以及离子区隔化的功能,提取了转基因和转空载体(对照)酵母突变体OC02的完整的液泡,对照OC02几乎没有K+/H+和Na+/H+的交换活性。转TaNHX2的酵母可以把K+和Na+泵入液泡,且其K+/H+交换活性远大于Na+/H+交换活性,这与酵母中Na+、K+离子含量的结果完全吻合。从中可以推测出TaNHX2使K+泵入液泡从而使H+进入胞质中,K+泵入液泡使得K+作为渗透剂维持细胞的膨压促使水分进入细胞内,K+的区隔化可以阻止有害的Na+进入细胞内。这种机制可以帮助我们更好的理解植物体内NHX蛋白与钾营养吸收的关系。

全文目录


致谢  4-11
摘要  11-13
Abstract  13-16
第一章 文献综述  16-34
  1 植物与盐胁迫  16-17
    1.1 盐胁迫对植物的影响  16-17
      1.1.1 渗透胁迫  16-17
      1.1.2 离子胁迫  17
      1.1.3 营养胁迫  17
  2 植物耐盐的生理机制  17-21
    2.1 Na~+外排  17-18
    2.2 Na~+区隔化  18
    2.3 拒盐  18
    2.4 合成渗透调节物质  18-20
      2.4.1 脯氨酸  19
      2.4.2 甜菜碱  19-20
      2.4.3 多元醇  20
    2.5 水通道蛋白  20
    2.6 胚胎后期表达蛋白(LEA蛋白)  20-21
  3 调控Na~+均衡的离子转运系统  21-32
    3.1 SOS调控途径  21-26
      3.1.1 SOS3基因的定位与表达  22-23
      3.1.2 SOS2基因的定位与表达  23-24
      3.1.3 SOS1基因的定位与表达  24-25
      3.1.4 SOS基因和植物耐盐的调控途径  25-26
    3.2 NHX途径  26-31
      3.2.1 NHX的分类及亚细胞定位  26-28
      3.2.2 NHX家族离子转运功能的特异性  28-30
      3.2.3 拟南芥AtNHX1的功能研究进展  30-31
    3.3 H~+-ATPase(质子泵)基因  31-32
  4 小麦与盐胁迫  32-34
第二章 小麦质膜Na~+/H~+逆转运蛋白TaSOS1的克隆与表达分析  34-48
  1 材料和方法  34-39
    1.1 植物材料  34-35
    1.2 实验方法  35-39
      1.2.1 RNA提取  35
      1.2.2 反转录反应  35
      1.2.3 TaSOS1基因的克隆  35-38
        1.2.3.1 引物序列  35-36
        1.2.3.2 PCR反应体系及条件  36
        1.2.3.3 TaSOS1与T-载体的连接  36
        1.2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  36-37
        1.2.3.5 质粒DNA提取  37-38
      1.2.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)  38-39
        1.2.4.1 引物序列  38
        1.2.4.2 RT-PCR反应体系及条件  38-39
  2 结果与分析  39-46
    2.1 TaSOS1的克隆及生物信息学分析  39-41
      2.1.1 TaSOS1的克隆  39
      2.1.2 TaSOS1的生物信息学分析  39-41
    2.2 TaSOS1在各种胁迫条件下的表达量分析  41-46
      2.2.1 RNA及cDNA检测  41-42
      2.2.2 标准曲线的建立  42-43
      2.2.3 熔解曲线  43-44
      2.2.4 TaSOS1基因在各种胁迫处理下的特异性表达  44-46
        2.2.4.1 NaCl胁迫条件下TaSOS1基因的表达模式  44
        2.2.4.2 4℃低温胁迫条件下TaSOS1基因的表达模式  44-45
        2.2.4.3 ABA胁迫条件下TaSOS1基因的表达模式  45
        2.2.4.4 PEG6000胁迫条件下TaSOS1基因的表达模式  45-46
  3 讨论  46-48
第三章 TaSOS1在酵母中的功能分析  48-64
  1 材料与方法  48-54
    1.1 TaSOS1转化酵母细胞  48-51
      1.1.1 酵母表达载体的构建  48-49
      1.1.2 实验中所用酵母培养基及氨基酸  49
      1.1.3 酵母菌株及酵母表达载体  49
      1.1.4 PEG4000-LiAc法化学转化酵母细胞  49-50
      1.1.5 酵母细胞DNA的提取  50
      1.1.6 转基因酵母的PCR检测  50-51
    1.2 酵母梯度点滴生长实验  51
    1.3 酵母细胞内离子含量测定  51-52
    1.4 酵母细胞质膜的提取  52-53
      1.4.1 粗膜制剂的获得  52
      1.4.2 两相系统的制备  52-53
    1.5 膜蛋白含量测定  53
    1.6 质膜纯度检测  53
    1.7 Na~+/H~+离子交换活性测定  53-54
  2 结果与分析  54-60
    2.1 酵母功能互补验证  54-56
    2.2 酵母细胞Na~+、K~+离子含量测定  56-57
    2.3 质膜纯度测定  57-58
    2.4 Na~+/H~+交换活性测定  58-60
  3 讨论  60-64
    3.1 盐胁迫条件转TaSOS1基因的酵母耐盐性  60-61
    3.2 转TaSOS1基因酵母对潮霉素B的耐逆性  61
    3.3 盐胁迫条件下转TaSOS1基因的酵母细胞内Na~+、K~+离子含量  61-62
    3.4 转TaSOS1基因酵母质膜的Na~+/H~+离子转运活性  62-64
第四章 小麦液泡膜Na~+/H~+逆转运蛋白TaNHX2的克隆与功能分析  64-82
  1 材料与方法  65-72
    1.1 植物材料  65
    1.2 实验方法  65-72
      1.2.1 TaNHX2基因的克隆  65-66
        1.2.1.1 小麦总RNA提取及反转录反应  65
        1.2.1.2 RT-PCR  65-66
      1.2.2 酵母功能互补验证  66-68
        1.2.2.1 酵母菌株  66
        1.2.2.2 酵母表达载体  66-67
        1.2.2.3 实验中所用酵母培养基及氨基酸  67
        1.2.2.4 TaNHX2亚克隆载体的构建  67
        1.2.2.5 转化酵母  67
        1.2.2.6 酵母梯度点滴生长实验  67-68
      1.2.3 酵母液泡膜的提取  68
      1.2.4 膜蛋白含量测定  68
      1.2.5 Western Blotting  68-70
        1.2.5.1 SDS-PAGE电泳  68-69
        1.2.5.2 Western转膜  69-70
      1.2.6 胁迫条件下酵母细胞内Na~+、K~+离子含量测定  70
      1.2.7 酵母细胞中完整液泡膜的分离  70-72
        1.2.7.1 构建酵母表达载体pDR195-TaNHX2  70-71
        1.2.7.2 转化酵母突变体OCO2  71
        1.2.7.3 液泡膜的提取  71-72
      1.2.8 Cation/H~+交换活性测定  72
  2 结果与分析  72-79
    2.1 TaNHX2的克隆  72-73
    2.2 TaNHX2的生物信息学分析  73-74
    2.3 Western Blot分析  74
    2.4 酵母功能互补验证  74-76
    2.5 转基因酵母Na~+、K~+离子含量测定  76-77
    2.6 Cation/H~+交换活性  77-79
  3 讨论  79-82
    3.1 TaNHX2的信息学分析  79
    3.2 TaNHX2在酵母中的耐盐性分析  79-80
    3.3 TaNHX2的离子转运活性  80-82
参考文献  82-92
攻读博士学位期间整理发表的论文  92

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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