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猪泛素蛋白酶体途径连接酶E3中FBXL相关基因的表达谱、SNPs检测及性状关联分析

作　者: 李勇
导　师: 彭克美；李奎
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: E3连接酶 FBXL亚家族 SNP 表达谱关联分析
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

泛素-蛋白酶体途径作为一种高效的蛋白降解途径,能够选择性地降解细胞内蛋白质,使各种蛋白质的降解受到精确的调控,这个途径对于维持细胞的许多重要生理功能如细胞周期的调控、抗原呈递、转录调控、细胞凋亡和细胞内信号转导等有着极其重要的作用。其中泛素连接酶E3在泛素-蛋白酶体途径中可特异性地识别靶蛋白,具有连接靶蛋白和特定泛素结合酶E2的重要作用。本研究采用生物信息学和分子生物学技术相结合的方法分离克隆了E3连接酶SCF复合物中的底物蛋白识别组分F-box蛋白中FBXL亚家族4个基因的部分基因组和DNA序列,并对其进行了组织表达谱、SNP检测及初步的免疫性状关联分析,获得以下结果：(1)利用人的同源基因mRNA序列查询获得猪新基因的EST,分离获得猪SKP2基因第一和第六内含子、FBXL4基因第二内含子、FBXL8基因第二内含子和jBXL11基因第18、19及第20内含子的序列,分离获得SKP2FBXL4基因的部分cDNA及完整CDS序列,并查询与分析了FBXL11的cDNA序列。(2)采用实时荧光定量PCR方法检测了猪SKP2mRNA和FBXL4mRNA在10种重要器官中的表达情况。其中猪SKP2mRNA在这些器官中均表达明显,但表达水平波动范围较大,胸腺具有最高表达水平,而背腰最长肌表达水平最低。猪FBXL4mRNA同样均有明显的表达水平及差异较大,肺表达水平最高,而心脏表达水平最低。(3)对猪SKP2、FBXL4、FBXL8和FBXL114个基因的相关内含子进行了SNP检测。结果发现有以下SNP位点：猪SKP2第一内含子的第819位存在SNP-Cfr42I(T／C)；猪FBXL4第二内含子包括分别位于第49位(C／T)、157位(A／T)、187位(A／G)、227位(G／T)、321位(G／A)、371位(G／A)、381位(C／T)和569位(C／A)的8个SNP位点。有趣的是,前4个位点和后4个位点属于同一个内含子中的一种连锁突变。因此仅选取分别代表前后4个位点的两个做验证分析,即第49位SNP-Tail和第381位SNP-BsaJI;猪FBXL11第18内含子的第377位存在SNP-TspEI(A/G)；另外猪FBXL8第二内含子在第325位、361位和493位分别具有G与A、C与T和A与G碱基突变。(4)对猪SKP2、FBXL4和FBXL113个基因的SNPs运用PCR-RFLP进行群体遗传学分析。从猪SKP2基因Cfr42I-RFLP在莱芜、巴马、五指山及贵州4种中国传统小型猪和温氏集团长白猪种得出的结果可知：等位基因A在所检测的五个猪种中占有绝对的优势,4种小型猪几乎属于纯合AA基因型；而长白猪种既有纯合AA也有杂合AG基因型。对于猪FBXL4基因,其中根据Tail-RFLP,长白猪种中纯合TT基因型占有绝对的优势,在其它3种中国传统小型猪种中,贵州和五指山两品种的纯合TT基因型个体具有明显的优势,但纯合CC基因型在莱芜猪种占有优势。而BsaJI-RFLP的结果表明,在贵州和五指山两小型猪及长白猪种群体中,纯合CC基因型具有显著的优势。猪FBXL11基因的TspEI-RFLP在温氏集团长白猪种资源群体的分析结果表明：等位基因G在长白猪种中占有绝对的优势,并包括有杂合AG和纯合GG两种基因型。(5)对猪SKP2和FBXL4两个基因的多态性与免疫性状进行了初步的关联分析。从猪SKP2基因的关联分析结果可知,第一内含子的SNP-Cfr42I与0日龄新生仔猪的红细胞分布宽度存在显著相关性,纯合AA基因型个体的红细胞分布宽度明显高于杂合AG基因型个体的红细胞分布宽度(P=0.027)对于猪FBXL4基因SNP-Tail的关联分析,结果显示纯合CC基因型0日龄新生仔猪的淋巴细胞百分数显著低于其它两种基因型淋巴细胞百分数(P=0.0166)。而另一个SNP-BsaJI的关联分析结果表明,具有纯合TT基因型的0日龄新生仔猪的中性粒白细胞百分数明显要高于其它两种基因型,具有极显著意义(P=0.0005)；纯合TT基因型32日龄个体的淋巴细胞百分数显著低于其它两种基因型(P=0.0351)。然而对于纯合CC基因型的0日龄新生仔猪,其绝对淋巴细胞数要显著高于其它两种基因型(P=0.0458),杂合TC型的0日龄新生仔猪的中间细胞数高于其它两种基因型的中间细胞数,具有极显著差异性(P=0.0010)。(6)运用clustalW2在线软件对猪SKP2、FBXL4和FBXL113个基因进行了系统进化树的构建与分析。3种基因的系统进化树的结果都表明：这些基因在物种间具有非常保守的分子特性；同时在这些比较的人和各种动物间,仅有猪和牛均属于系统树结构中的同一组,具有最近的进化亲缘关系特征。(7)通过运用motif scan网站对猪SKP2和FBXL4两个基因进行了推导蛋白结构域的鉴定和分析。猪SKP2蛋白的结果显示：位于第90至140个氨基酸间,具有一个含51个氨基酸的保守F-box结构域,这表明其属于F-box蛋白,预测还可能具有其它8个相似的富含亮氨酸的重复序列。而猪FBXL4基因的结果同样显示该蛋白具有一个含56个氨基酸的保守F-box结构域,其分布位置在第277至332个氨基酸之间,说明其同样属于F-box蛋白的成员。

全文目录

中文摘要  9-12
ABSTRACT  12-15
缩略词表(Abbreviations)  15-16
性状中英文对照和缩写  16-17
1 文献综述  17-33
  1.1 泛素-蛋白酶体途径研究概况  17-20
    1.1.1 泛素-蛋白酶体途径的组成  17-19
    1.1.2 泛素-蛋白酶体途径的作用机制  19
    1.1.3 泛素-蛋白酶体途径的部分细胞功能  19
    1.1.4 泛素-蛋白酶体途径与疾病  19-20
  1.2 E3连接酶简介  20-22
    1.2.1 E3连接酶种类  20-21
    1.2.2 SCF复合物  21-22
  1.3 F-box蛋白家族研究进展  22-25
    1.3.1 F-box蛋白家族的分类  22-23
    1.3.2 F-box蛋白家族的结构  23-24
    1.3.3 F-box蛋白家族的作用机制和生理功能  24
    1.3.4 F-box蛋白家族与疾病关系  24-25
  1.4 SKP2基因的研究进展  25-33
    1.4.1 SKP2的结构  25
    1.4.2 SKP2的功能  25-29
    1.4.3 SKP2在人类肿瘤中的研究概况  29-30
    1.4.4 SKP2的转录调控研究概况  30-31
    1.4.5 SKP2的启动子研究概况  31-33
2 研究目的和意义  33-34
3 材料与方法  34-46
  3.1 材料  34-37
    3.1.1 样品  34
    3.1.2 试剂  34-36
    3.1.3 主要仪器设备  36-37
    3.1.4 主要分子生物学软件  37
    3.1.5 主要分子生物学网站  37
  3.2 方法  37-46
    3.2.1 DNA、RNA及cDNA样本的制备  37-39
    3.2.2 基因DNA片段和cDNA的分离方法  39-42
    3.2.3 基因组织表达谱分析方法  42-43
    3.2.4 基因多态性检测方法  43-44
    3.2.5 基因多态与性状关联分析方法  44
    3.2.6 蛋白序列结构域鉴定方法  44-45
    3.2.7 蛋白序列比对及进化树构建方法  45-46
4 结果  46-91
  4.1 猪SKP2基因的部分分子鉴定、组织表达谱、SNP检测和性状关联分析  46-61
    4.1.1 组织总RNA的电泳凝胶及cDNA检测  46-47
    4.1.2 猪SKP2基因相关扩增程序及引物  47-49
    4.1.3 猪SKP2基因的部分分子鉴定结果  49-52
    4.1.4 多态性检测及群体遗传学分析  52-55
    4.1.5 猪SKP2基因组织表达谱分析  55
    4.1.6 免疫性状关联分析  55-56
    4.1.7 系统进化树分析  56-57
    4.1.8 猪SKP2推导蛋白的结构域鉴定分析  57-59
    4.1.9 讨论  59-61
  4.2 猪FBXL4基因的部分分子鉴定、组织表达谱、SNP检测和性状关联分析  61-75
    4.2.1 猪FBXL4基因相关扩增程序及引物  61-63
    4.2.2 猪FBXL4基因的部分分子鉴定结果  63-65
    4.2.3 多态性检测及群体遗传学分析  65-68
    4.2.4 免疫性状关联分析  68-69
    4.2.5 猪FBXL4基因的组织表达谱分析  69-70
    4.2.6 系统进化树构建  70-71
    4.2.7 猪FBXL4推导蛋白的结构域鉴定分析  71-73
    4.2.8 猪FBXL4基因的基因组结构  73-74
    4.2.9 讨论  74-75
  4.3 猪FBXL11基因的部分分子鉴定、SNP检测和表达谱分析  75-87
    4.3.1 猪FBXL11基因相关扩增程序  75
    4.3.2 猪FBXL11基因的部分分子鉴定结果  75-79
    4.3.3 猪FBXL11基因第18内含子多态性检测及基因分型  79-80
    4.3.4 猪FBXL11基因的cDNA序列分析  80-83
    4.3.5 猪FBXL1l基因的表达谱  83-84
    4.3.6 猪FBXL11蛋白的结构域组成  84-86
    4.3.7 系统进化树构建  86
    4.3.8 讨论  86-87
  4.4 猪FBXL8基因第二内含子分子克隆与SNP检测分析  87-91
    4.4.1 扩增引物  87
    4.4.2 PCR扩增程序  87-88
    4.4.3 猪FBXL8基因第二内含子序列分析  88-89
    4.4.4 SNP检测  89
    4.4.5 讨论  89-91
5 小结  91-95
  5.1 研究结果  91-93
  5.2 研究创新之处  93-94
  5.3 研究不足之处及所引申的问题  94-95
参考文献  95-103
附图1 猪SKP2和人SKP2的第一内含子的序列对比分析  103-104
附图2 猪SKP2基因CDS序列对比分析  104-108
附图3 猪FBXL4基因CDS序列对比分析  108-113
附图4 猪FBXL11基因CDS序列对比分析  113-122
附图5 猪FBXL11与人FBXL11的第18内含子序列对比分析  122-123
附图6 猪FBXL11和人FBXL11的第19内含子序列对比分析  123-124
附图7 猪FBXL11和人FBXL11的第20内含子序列对比分析  124-125
个人简介  125-126
在读期间发表论文题录  126-127
学术活动情况  127-128
致谢  128-130

猪泛素蛋白酶体途径连接酶E3中FBXL相关基因的表达谱、SNPs检测及性状关联分析

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