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人源菌群仔猪模型的建立及其胃肠道黏膜免疫的研究

作　者: 车传燕
导　师: 杨倩；赵立平
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 人源菌群仔猪模型 消化道黏膜免疫 促炎症细胞因子 肠道菌群 果寡糖
分类号: S858.28
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究首先利用猪在解剖、组织、生理和营养代谢尤其是消化系统方面与人高度相似的特性,摸索建立一种肠道中定植人源菌群(Human Flora-associated,HFA)的仔猪模型；研究人的肠道共生菌对该模型仔猪胃肠道形态、血清中促炎细胞因子和局部黏膜免疫细胞的影响；在此基础上,探讨肠道优势菌群对无菌仔猪胃肠道黏膜免疫影响的可能机制；在该模型建立的基础上,研究果寡糖类益生元对人源菌群仔猪肠道黏膜免疫的影响。结果如下：1人源菌群仔猪模型的建立为了成功建立人源菌群仔猪模型,本试验通过五次独立试验对试验仔猪的品种、粪悬液的来源和饲养管理条件等进行了探讨。前两次试验选用贵州香猪,后三次试验选用中国的土种猪梅山猪。将无菌剖腹产手术获得的仔猪通过传递窗快速送入无菌屏障系统,试验均在无菌屏障系统中完成。五次试验中所用的无菌仔猪头数依次分别为9,13,10,12,8头。仔猪出生12h后,在确认仔猪吃乳和健康状况良好的情况下,经口服途径接种人粪便菌悬液。前三次试验采用一健康10岁儿童的粪便菌悬液,后两次试验采用健康成人的粪便菌悬液。前3 d每只仔猪每天接种1ml,4-10日龄每隔1 d接种一次,剂量为1ml／次。在饲养管理过程中,采用人工哺乳的方法饲喂仔猪,断奶前采用猪用奶粉,断奶后采用婴儿米粉。合理控制饲养室的温度。适时补充铁剂、维生素和微量元素。观察仔猪的精神状态和生长情况,分析不同时间段仔猪的成活率。结果显示,与贵州香猪相比,梅山猪的生长发育很好,成活率明显升高；灌喂健康成人粪便菌悬液的梅山猪比健康儿童粪便菌悬液的生长发育要好,成活率也高。试验结果表明选用梅山猪和健康成人的粪便菌悬液更适合于建立人源菌群仔猪模型。2人的肠道共生菌对人源菌群仔猪胃肠道形态和血清前炎症细胞因子的影响将无菌剖腹产手术获得的16头健康无菌仔猪称重,随机分为两组,人源菌群组(HFA,n=8)和猪源菌群组(PFA,n=8),分别口服接种人和猪的粪便菌悬液。所有仔猪饲养于无菌的屏障系统内,人工哺乳喂养。6周后空腹称重,静脉放血处死动物,收集血液离心取血清；采集胃肠放入Bouin’s液中固定。应用H／E染色显示胃肠组织学形态。应用ELISA试剂盒测定血清中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平。结果显示：1)两组仔猪生长发育很好,但人源菌群组仔猪的日增重显著高于猪源菌群组(p<0.05).2)人源菌群组仔猪的空肠绒毛高度和隐窝深度显著高于猪源菌群组(p<0.05)。3)与猪源菌群组仔猪相比,人源菌群仔猪血清中的细胞因子TNF-α显著降低(p<0.05),IL-1β的水平很低,用试剂盒几乎检测不到.实验结果表明人的肠道共生菌定植在仔猪肠道后,刺激了仔猪空肠的发育,促进了仔猪的生长,对维持机体的健康起到重要作用。3人的肠道共生菌对人源菌群仔猪胃肠道局部黏膜免疫水平的影响取人源菌群组(HFA,n=8)和猪源菌群组(PFA,n=8)仔猪的胃底部、胃体部、胃幽门部,十二指肠、空肠、回肠和结肠组织样品,应用组织化学和免疫组织化学方法来检测胃肠道黏膜免疫细胞的变化。结果显示：1)人源菌群仔猪小肠上皮内淋巴细胞的数量极显著低于猪源菌群仔猪(p<0.01)；含中性黏蛋白的杯状细胞数量显著升高(p<0.05),但小肠中总的杯状细胞和肥大细胞的数量差异不显著.2)与猪源菌群组仔猪相比,人源菌群组仔猪胃幽门部(p<0.05)和空肠(p<0.01)中IgA生成细胞的面积均显著增加.胃的三个部位中IgG生-成细胞的面积均有增加,但差异不显著；十二指肠、空肠和回肠中IgG生成细胞的面积均极显著增加(p<0.01)。3)与猪源菌群组仔猪相比,人源菌群组仔猪空肠中CD4+T细胞的含量极显著增高(p<0.01)。4)人源菌群组仔猪肠黏膜中MHCⅡ类分子表达细胞的数量在十二指肠(p<0.01)和结肠(p<0.05)中分别显著高于猪源菌群组仔猪。5)IgA和IgG生成细胞、CD4+T细胞和MHCⅡ类分子表达细胞的数量在两组仔猪的肠道中具有类似的分布趋势。上述结果表明人的肠道共生菌群刺激了无菌仔猪小肠局部黏膜免疫功能的增强,但未改变黏膜免疫细胞在肠道不同部位的分布特征。4人源菌群仔猪肠道优势菌群组成的研究收集人源菌群组(HFA,n=8)和猪源菌群组(PFA,n=8)仔猪的粪便样品,应用微生物分子生态学方法测定粪便样品中四种主要优势菌群,拟杆菌类群、梭菌类群、双歧杆菌类群和乳酸菌类群的含量和双歧杆菌的组成。结果显示：1)肠道的优势菌群如拟杆菌、梭菌、双歧杆菌和乳酸菌在人源菌群仔猪和猪源菌群仔猪的粪便样品中都能检测到。人粪便中的拟杆菌和梭菌的含量极显著高于人源菌群仔猪,但乳酸菌的含量则极显著低于人源菌群仔猪(p<0.01),双歧杆菌的含量没有显著差异；猪粪便中的拟杆菌类群的含量极显著低于猪源菌群仔猪(p<0.01),梭菌、双歧杆菌和乳酸菌的含量没有明显差异。2)与猪源菌群组仔猪相比,人源菌群组仔猪粪便中双歧杆菌的含量极显著增高(p<0.01),而且两组仔猪粪便中双歧杆菌的组成也不同,其他三种菌群的含量没有明显差异。试验结果表明人源菌群仔猪的肠道菌群组成和数量明显不同于猪源菌群仔猪,提示肠道共生菌对肠道健康和发育具有重要的作用。5果寡糖对人源菌群仔猪肠道黏膜免疫细胞的影响将无菌剖腹产手术获取的15头健康仔猪称重,随机分为三组：第一组为SPF组(Specific Pathogen Free,对照组),经口灌服磷酸钠缓冲液(内含10%甘油)；第二组为HFA组(人源菌群组),经口灌服人粪便菌悬液,前三天每只仔猪每天灌服1ml菌液,4-10日龄每隔一天灌服菌液一次,剂量仍为1ml；第三组为FOS组(Fructo-oligosaccharides,果寡糖组),每头仔猪除灌服人粪便菌悬液外,在整个饲养期内按0.5 g／kg体重饲喂果寡糖。所有仔猪饲养于屏障系统内,无菌条件下进行人工哺育。45 d后空腹称重,宰杀取十二指肠、空肠、回肠和结肠。应用组织化学和免疫组织化学方法研究仔猪肠道黏膜免疫细胞的变化。结果显示：1)果寡糖能够提高仔猪的日增重。2)与人源菌群组相比,果寡糖能够使空肠中IgA生成细胞的含量显著增高(p<0.05),使IgG生成细胞的含量在十二指肠极显著降低(p<0.01)；小肠上皮内淋巴细胞和肥大细胞的数量在两组之间没有显著差异。3)与对照组相比,人源菌群和果寡糖都能使回肠中IgA生成细胞的含量极显著增加(p<0.01),人源菌群能够促进十二指肠中IgG生成细胞的含量极显著增加(p<0.01)。实验结果提示果寡糖对人源菌群仔猪小肠黏膜上皮具有一定的保护作用,但对小肠局部黏膜免疫的增强作用不是很大,这可能与果寡糖添加时间较早有关。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-14
缩写中英文对照  14-15
引言  15-17
第一篇 文献综述  17-67
  第一章 消化道黏膜免疫  17-33
    1 消化道黏膜免疫系统的组成  17-23
    2 消化道黏膜免疫的效应因子—SIgA  23-24
    3 消化道黏膜免疫应答  24-26
    4 消化道黏膜免疫的调节  26-28
    参考文献  28-33
  第二章 胃肠道微生物与黏膜免疫  33-51
    1 胃肠道微生物的组成  33-36
    2 肠道共生菌与机体黏膜免疫系统的相互作用  36-40
    3 研究肠道菌群的相关技术  40-44
    参考文献  44-51
  第三章 人源菌群动物模型的研究进展  51-59
    1 人源菌群动物模型的产生  51-52
    2 HFA大/小鼠模型的研究进展  52-53
    3 人源菌群仔猪模型的建立  53-56
    参考文献  56-59
  第四章 益生元的研究进展  59-67
    1 益生元的类型  59-60
    2 益生元的作用  60-64
    参考文献‘  64-67
第二篇 试验研究  67-151
  第一章 人源菌群仔猪模型的建立  67-79
    1 材料与方法  67-73
    2 结果与分析  73-75
    3 讨论  75-77
    参考文献  77-79
  第二章 人肠道共生菌对无菌仔猪胃肠道形态和血清中促炎细胞因子水平的影响  79-89
    1 材料与方法  79-82
    2 结果与分析  82-85
    3 讨论  85-87
    参考文献  87-89
  第三章 人肠道共生菌对无菌仔猪胃肠道IgA和IgG生成细胞的影响  89-101
    1 材料与方法  89-90
    2 结果与分析  90-97
    3 讨论  97-99
    参考文献  99-101
  第四章 人肠道共生菌对无菌仔猪小肠上皮内淋巴细胞、肥大细胞和杯状细胞的影响  101-111
    1 材料与方法  101-102
    2 结果与分析  102-106
    3 讨论  106-108
    参考文献  108-111
  第五章 人肠道共生菌对无菌仔猪肠道CD4~+T细胞和MHCⅡ类分子的影响  111-121
    1 材料与方法  111-112
    2 结果与分析  112-116
    3 讨论  116-118
    参考文献  118-121
  第六章 人源菌群仔猪肠道中重要菌群的定量分析  121-139
    1 材料与方法  121-125
    2 结果与分析  125-134
    3 讨论  134-136
    参考文献  136-139
  第七章 果寡糖对人源菌群仔猪肠道黏膜免疫细胞的影响  139-151
    1 材料与方法  139-141
    2 结果与分析  141-146
    3 讨论  146-148
    参考文献  148-151
总体讨论  151-157
全文结论  157-159
本文创新点  159-161
附录1.阴性对照图片  161-162
附录2.溶液试剂及配制  162-163
附录3.实验中所用的仪器设备  163-165
博士期间发表和完成的论文  165-167
致谢  167

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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