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β-榄香烯固体脂质纳米粒的研究

作　者: 王艳芝
导　师: 毕殿洲；邓意辉
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 肿瘤 β-榄香烯 固体脂质纳米粒(SLN) 聚乙二醇单甲醚(2000)胆固醇琥珀酸酯(CHS-PEG) N-硬脂酰基-N’-蝶酰谷氨酰基-聚乙二醇二胺(FA-PEG-S) HPLC 药动学 组织分布 H22瘤 抑瘤率
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


对现有药物进行深入研究和探索，将其制成新的剂型，在增加药物的有效性、靶向性的同时，减少药物的毒副作用，乃是当前抗肿瘤研究的主要方向之一。β-榄香烯作为我国开发研制的抗癌中药有效成分，具有抗癌谱广、毒副作用少并能保护患者免疫功能的优点。但是该药制剂品种单一、静脉炎发生率高，严重影响了疗效的充分发挥。本论文的主要研究目的是将β-榄香烯制备成固体脂质纳米粒（SLN）制剂供静脉给药，以增强β-榄香烯对肿瘤的靶向性，提高抗肿瘤效果，降低对静脉的刺激作用。具体研究内容如下：首先探讨采用微乳法和超声-挤压过滤法制备β-榄香烯SLN的可行性并筛选出优化处方。结果显示，微乳法所制SLN的平均体均粒径虽小（20.6nm），但是制剂中微米级大粒子占体均粒径分布的19.1％，且固体含量只有1％。而采用超声-挤压过滤法制备SLN未见文献报道，该方法先以探头式超声将制剂初步分散，然后在高温下将初分散液挤压通过微孔滤膜，由于初分散液中大于微孔孔径的粒子被挤压成几个小粒子，因而降低了制剂中大粒子的粒径，如果选用0.22μm的微孔滤膜，可同时达到滤除细菌和去除大微粒的目的。为方便制备，自组装了一套装置用于控温。但是采用通常的制剂组成和制备程序不能得到稳定性与包封率皆高的制剂，故进行了以下两方面的尝试。首先，在制备程序上，初次提出将表面活性剂加入脂质的方法（SL法）并与常用的将表面活性剂加入水相的方法（SW法）相比较，结果SL法与SW法相比，可以降低制备初期水相中表面活性剂的浓度，从而减少游离药物向水相的分布程度，提高制剂的包封率并可降低粒径。其次，在制剂组成上，首次将单硬脂酸甘油酯和Preeirol ATO 5以不同比例混合，并以稳定性为主要考察指标，确定优化制剂组成。结果筛选出组成为250mg泊洛沙姆188、150mg单硬脂酸甘油酯、350mg Precirol ATO 5和10mL水，β-榄香烯的浓度为5.6mg．mL-1的优化制剂SLN-1，该制剂至少可以在室温稳定储存8个月。以优化制剂SLN-1为主，采用多种手段从多方面考察SLN的理化性质，其中着重考察了脂质的结晶与晶型转化情况，以探讨优化制剂稳定性较高的可能原因。主要考察内容及结果包括1)粒径：分别采用COULTER DELSA 440SX、Nicomp-380和Coulter LS 230测定SLN-1的粒径。结果显示，绝大多数SLN-1的粒径小于100nm，可以满足肿瘤靶向对制剂粒径的要求。2)ζ电势：分别采用COULTER DELSA 440SX和Nicomp-380测定SLN的ζ电势，结果表明SLN普遍带负电荷。进一步的考察结果说明，稀释介质可以影响SLN的ζ电势，以蒸馏水为稀释介质时，稀释倍数越高，SLN的绝对ζ电势越大；相同稀释倍数下，不同制剂的绝对ζ电势随制剂中泊洛沙姆188含量的增加而降低，随单硬脂酸甘油酯的增加而升高。3)体外释放：以36％乙醇水溶液为释放介质，考察β-榄香烯自SLN-1中的释放情况。1h内β-榄香烯的累积释放百分率为6.3％，24h后为53.6％，84h内可以释放完全。释放数据分别与First order，Higuchi和Weibull方程拟和，结果与Higuchi方程的拟合度较高。4)形态：使用透射电镜观察SLN制剂的形态，所观察到的SLN-1、SLN-2以及SLN-3的形态皆为小盘形，SLN-2的粒子表面似乎吸附了油滴，SLN-1的平均粒径在50 nm左右。5)物理和化学稳定性：室温（18-25℃）避光储存8个月后，SLN-1的外观、平均粒径及包封率等特征与制备初期相比没有显著差别。室温放置18个月后，其pH值和红外光谱与新制备样品非常相似，这表明SLN-1具有较好的化学和物理稳定性。6)脂质的结晶与晶型转化：将SLN在室温自然干燥后制备DSC样品并测定，考察的结果为SLN-1和空白SLN-2、SLN-3均在制备初期出现过冷熔融现象并逐渐以亚稳构型结晶，但是SLN-2和SLN-3在2个月后即向更稳定构型转化，而SLN-1在8个月时仍为亚稳构型，因此SLN-1中的脂质能够较长时间保持亚稳构型可能是其稳定性较高的主要原因。首次建立了GC和HPLC两种方法用于测定SLN中β-榄香烯的含量。GC法基线斜率较大，且无法解决对色谱柱的污染以及柱效快速下降等难题；采用HPLC法可以避免这些问题，对SLN制剂的质量监测也更为方便。另外建立了HPLC法用于β-榄香烯的体内分析研究。根据药物及制剂的特点，建立一种新的分离游离药物与包封药物的方法，即聚结过滤法，用于β-榄香烯SLN包封率的测定。该法操作简单、快速，结果准确。采用本法测定的β-榄香烯SLN-1的包封率为96.0±0.41％。为实现将SLN靶向于肿瘤细胞表面叶酸受体，首次合成叶酸复合物N-硬脂酰基-N′-蝶酰谷氨酰基-聚乙二醇二胺（FA-PEG-S），以用于叶酸受体靶向型SLN（PEG-FA-SLN）的制备。纯化的产物经TLC、IR和1H-NMR分析得到确证。大鼠尾静脉分别给予SLN-1、PEG-FA-SLN和对照乳剂三种制剂，测定各组大鼠血浆和主要脏器中β-榄香烯的浓度，计算各制剂的药动学参数并比较其在各主要脏器中的浓度差别。结果显示，SLN-1的消除半衰期为15.6 min，与对照乳剂相比没有明显差别，但是两种制剂在对脏器的亲和性方面存在着显著差别，具体体现在，静脉注射后5 min，SLN-1在肝、脾和肾中β-榄香烯的浓度分别是对照乳剂的1.5、2.9和1.4倍，而在心脏和肺中的浓度为乳剂的70％。PEG-FA-SLN中含有4％CHS-PEG和0.1％FA-PEG-S（摩尔浓度），其消除半衰期为44.0 min，较SLN-1显著延长，而且具有不同于SLN-1和对照乳剂的组织分布规律：PEG-FA-SLN与SLN-1相比，5 min时在肝和肾中浓度较高，在脾中稍低；30和60 min时，PEG-FA-SLN在各脏器中的浓度均较SLN-1和对照乳剂高，肺脏除外。荷H22瘤小鼠静脉给药(84.2 mg．kg-1)，通过测定肿瘤中β-榄香烯的浓度，对SLN制剂（SLN-1、PEG-SLN和PEG-FA-SLN）以及对照乳剂的肿瘤靶向性加以比较。同时为确定影响制剂静脉给药肿瘤靶向性的主要因素，测定了对照乳剂和SLN-1瘤内注射给药后在肿瘤中的饱和滞留浓度以及静脉给药后的血药浓度。试验数据表明，各制剂在20min内即可在肿瘤中达到最高浓度，并至少在8h内保持该浓度，其中SLN组各制剂在瘤中的最高β-榄香烯浓度约为21μg．g-1，显著高于对照乳剂的13μg．g-1，显而易见，SLN制剂的静脉给药肿瘤靶向性高于对照乳剂，SLN组各制剂之间没有显著差异。经过测算，对照乳剂和SLN-1在肿瘤中的平均饱和滞留浓度分别为200.22±45.67μg．g-1和29.25±4.49μg．g-1，而静脉给药20 min内，对照乳剂的血药浓度不低于SLN-1。从上述试验结果可以推断出，在该实验条件下，制剂对肿瘤的亲和力是影响其对肿瘤靶向性的主要原因，由于与对照乳剂相比对肿瘤的亲和力较高，因而SLN-1具有较高的肿瘤靶向性。小鼠腋下种植H22肿瘤，尾静脉推注给药(42.1 mg．kg-1)后观察制剂的抑瘤情况。三种μ-榄香烯SLN制剂PEG-FA-SLN、PEG-SLN和SLN-1对肿瘤生长的抑制率分别为49.50％、48.87％和47.78％，显著高于对照乳剂的18.68％。β-榄香烯制剂均可不同程度的激活免疫器官，而且对动物的毒性很小。通过兔耳缘静脉给药观察了β-榄香烯制剂对静脉的刺激程度。与对照乳剂相比，SLN-1可显著降低对静脉的刺激作用。

全文目录


中文摘要  14-17
英文摘要  17-21
前言  21-44
第一章 β-榄香烯固体脂质纳米粒的制备  44-78
  1 材料与仪器  44-45
    1.1 材料  44
    1.2 仪器  44-45
  2 试验方法  45-49
    2.1 微乳法制备β-榄香烯SLN  45-46
      2.1.1 伪三元相图的绘制方法  45
      2.1.2 微乳法制备SLN的方法  45
      2.1.3 制备工艺单因素考察  45
      2.1.4 不同处方制备SLN的初步考察  45-46
      2.1.5 单因素考察质量评价方法  46
      2.1.6 优化处方的表征  46
    2.2 超声-挤压过滤法制备β-榄香烯SLN  46-49
      2.2.1 制备装置与温度控制能力考察方法  46-47
      2.2.2 制备方法SL和SW  47
      2.2.3 处方及工艺的质量评价方法  47-48
      2.2.4 挤压过滤对制剂质量的影响试验  48
      2.2.5 水相中表面活性剂浓度对制剂稳定性的影响试验  48
      2.2.6 超声单因素考察试验  48
      2.2.7 表面活性剂与脂质的筛选方法  48
      2.2.8 优化处方筛选  48-49
  3 结果与讨论  49-74
    3.1 微乳法制备β-榄香烯SLN  49-61
      3.1.1 伪三元相图中微乳的形成规律  49-57
      3.1.2 工艺因素对SLN质量的影响  57-58
      3.1.3 处方因素对SLN的质量的影响  58-60
      3.1.4 微乳法制备β-榄香烯SLN的质量初步评价  60-61
    3.2 超声-挤压过滤法制备β-榄香烯SLN  61-74
      3.2.1 超声-挤压过滤法制备SLN的可行性研究  61-64
      3.2.2 质量评价方法的确定  64-65
      3.2.3 水相中表面活性剂浓度对稳定性的影响  65-66
      3.2.4 制备方法的影响  66-68
      3.2.5 表面活性剂的考察结果  68
      3.2.6 脂质的选择及其含量的确定  68-70
      3.2.7 超声条件的确定  70-71
      3.2.8 处方因素考察  71-74
  本章小结  74-75
  参考文献  75-78
第二章 β-榄香烯固体脂质纳米粒的理化性质  78-101
  1 材料与仪器  78
    1.1 材料  78
    1.2 仪器  78
  2 试验方法  78-81
    2.1 透射电镜法观察SLN形态  78
    2.2 粒径的测定方法  78-79
    2.3 ζ电势的测定  79-80
    2.4 体外释放试验  80
    2.5 基质化学稳定性的测定  80
    2.6 DSC法考察脂质晶型转变的测定条件和样品制备  80
    2.7 SLN制剂稳定性影响因素试验及长期稳定性考察方法  80-81
  3 结果与讨论  81-98
    3.1 粒径测定结果  81-83
    3.2 ζ电势的测定与比较  83-87
    3.3 SLN-1在36％乙醇中的释放规律  87-89
    3.4 SLN-1中基质化学稳定性的初步测定结果  89-90
    3.5 DSC法考察脂质晶型转变的研究  90-95
    3.6 透射电镜观察SLN形态  95-97
    3.7 影响制剂稳定性的因素研究  97-98
    3.8 β-榄香烯SLN-1在室温的长期稳定性  98
  本章小结  98-99
  参考文献  99-101
第三章 β-榄香烯含量及包封率测定方法的研究  101-114
  第一节 β-榄香烯含量的测定  101-107
    1 材料与仪器  101
      1.1 材料  101
      1.2 仪器  101
    2 方法与结果  101-106
      2.1 气相色谱法测定SLN中β-榄香烯含量方法的建立  101-103
        2.1.1 色谱条件  101-102
        2.1.2 溶液配制  102
        2.1.3 方法可行性  102
        2.1.4 标准曲线的绘制  102-103
        2.1.5 仪器精密度  103
        2.1.6 方法精密度  103
        2.1.7 回收率  103
      2.2 高效液相色谱法测定β-榄香烯含量方法的建立  103-105
        2.2.1 色谱条件  103
        2.2.2 溶液配制  103
        2.2.3 方法可行性  103-104
        2.2.4 标准曲线的绘制  104
        2.2.5 仪器精密度  104
        2.2.6 方法精密度  104-105
        2.2.7 回收率  105
        2.2.8 稳定性  105
      2.3 SLN和乳剂中β-榄香烯的含量  105
      2.4 β-榄香烯在不同介质中近似溶解度的测定  105-106
    3 讨论  106-107
  第二节 β-榄香烯SLN的包封率测定方法与结果  107-112
    1 材料与仪器  107
    2 方法和结果  107-111
      2.1 聚结过滤法测定β-榄香烯SLN包封率的原理  107-108
      2.2 游离与包封于SLN中β-榄香烯分离方法的建立  108-111
      2.3 SLN样品中β-榄香烯包封率的测定结果  111
    3 讨论  111-112
  本章小结  112
  参考文献  112-114
第四章 叶酸受体靶向化合物(FA-PEG-S)的合成  114-122
  1 材料与仪器  114
    1.1 材料  114
    1.2 仪器  114
  2 实验方法  114-116
    2.1 N-硬脂酰基-N’-蝶酰谷氨酰基-聚乙二醇二胺(FA-PEG-S)的合成路线  114-116
    2.2 FA-PEG-S的确证方法  116
  3 结果与讨论  116-121
    3.1 合成产物的确证结果  116-120
    3.2 合成方法的选择  120-121
  本章小结  121
  参考文献  121-122
第五章 β-榄香烯固体脂质纳米粒大鼠体内药动学与组织分布  122-137
  1 材料与仪器  122
    1.1 材料  122
    1.2 仪器  122
    1.3 试验动物  122
  2 实验方法  122-127
    2.1 大鼠体内β-榄香烯含量测定方法的建立  122-125
    2.2 叶酸受体靶向SLN制剂的处方与制备  125-126
    2.3 给药方案与样品采集  126-127
    2.4 数据处理及统计分析  127
  3 结果与讨论  127-135
    3.1 普通β-榄香烯SLN制剂与对照乳剂的药时曲线与药代动力学参数  128-129
    3.2 叶酸受体靶向SLN制剂的药时曲线与药代动力学参数  129-132
    3.3 组织分布特点  132-135
  本章小结  135
  参考文献  135-137
第六章 β-榄香烯固体脂质纳米粒静脉给药后在荷瘤小鼠血浆及肿瘤中的药代动力学  137-155
  1 材料与仪器  137
    1.1 材料  137
    1.2 仪器  137
    1.3 试验动物及瘤株  137
  2 试验方法  137-142
    2.1 小鼠血浆和肿瘤中β-榄香烯分析方法的建立  138-141
    2.2 肿瘤接种与给药方案  141
    2.3 乳剂及原料药中β-榄香烯在肿瘤匀浆液中的稳定性研究  141
    2.4 数据处理及统计分析  141
    2.5 靶向性评价方法  141-142
    2.6 影响β-榄香烯制剂在肿瘤中分布与代谢的因素考察  142
  3 结果与讨论  142-153
    3.1 β-榄香烯SLN制剂和对照乳剂的平均粒径及ζ电势  142-143
    3.2 荷瘤小鼠静脉注射β-榄香烯制剂后血浆中的药时曲线与药动学参数  143-144
    3.3 β-榄香烯制剂在瘤内的药时曲线与靶向性分析  144-148
    3.4 影响β-榄香烯制剂肿瘤靶向性的因素分析  148-152
    3.5 给药剂量对静脉给药后瘤内药物滞留浓度的影响  152-153
    3.6 乳剂及原料药在肿瘤匀浆液中的稳定性  153
  本章小结  153-154
  参考文献  154-155
第七章 β-榄香烯固体脂质纳米粒静脉给药对小鼠肿瘤的抑制作用及静脉刺激性研究  155-162
  1 材料与仪器  155
    1.1 材料  155
    1.2 仪器  155
    1.3 试验动物及瘤株  155
  2 实验方法  155-156
    2.1 肿瘤接种与给药方案  155-156
    2.2 抑瘤率的计算  156
    2.3 免疫器官指数的测定  156
    2.4 β-榄香烯SLN的静脉刺激实验研究  156
    2.5 数据统计学分析  156
  3 结果与讨论  156-160
    3.1 抑瘤作用结果及分析  156-159
    3.2 β-榄香烯制剂的体内毒性分析  159
    3.3 静脉刺激性  159-160
  本章小结  160-161
  参考文献  161-162
全文结论  162-164
致谢  164-165
作者简介  165

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