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免疫和DNA杂交分析中纳米粒子线性光散射探针的研究

作　者: 杜保安
导　师: 李正平
学　校: 河北大学
专　业: 分析化学
关键词: 金纳米粒子光散射免疫分析 DNA杂交分析单碱基多态性
分类号: TB383.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

在本文中,首先对DNA杂交分析和免疫分析的发展及现状作了一般性综述。在第二章中应用纳米粒子作探针结合光散射检测技术,用人免疫球蛋白和羊抗人免疫球蛋白的特异性反应为反应模式,建立了简单、快速、灵敏度高、特异性好、普遍适用的均相免疫分析方法。抗体标记的金纳米粒子为探针与相应的抗原在溶液中混合后,通过抗体抗原的特异性反应,使纳米金形成网状的聚集体,在pH值为7.0的缓冲溶液中,随着聚集体的形成,溶液的光散射强度极大的提高。基于这种现象建立的蛋白质的检测方法其动态范围可达到0.05—10μg／mL,检出限可达到10ng／mL。所建立的分析方法能够在均相溶液中通过一步免疫反应完成。在室温下,光散射强度在10分钟之内就可达到最大值。这种方法与其它的均相分析方法相比较,其灵敏度更高,速度更快,操作也更简单。它避免了异相分析方法中的多步反应和多步洗涤,因而也避免了多步操作中所引入的误差。本文所建立的均相免疫分析方法曾成功的应用于人血清样品中的人免疫球蛋白的分析,其结果与标准的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法相比较,吻合的非常好,表明本方法的特异性和可行性极高。因此,本文以抗体标记的金纳米粒子为探针结合光散射检测技术建立的免疫分析方法,可以作为一般模式,用于分子生物学和医学诊断中任何蛋白质的分析。本文的第三章用单链DNA标记的金纳米粒子为探针,建立了均相、高灵敏度的DNA杂交分析方法,实现均相溶液中目标链的一步检测。在均相溶液中,与探针链相匹配的目标链通过杂交反应诱导金纳米粒子形成网状的交联聚集体,溶液的光散射强度随着聚集体的增大而增强。溶液的光散射强度可以用普通的荧光分光光度计通过激发光与发射光的同步扫描记录下来。用这种检测方法,在优化的实验条件下,复杂溶液体系中低至100fmol／L的单链DNA可以被准确地检测出来。与均相溶液中的比色检测方法想比较,其灵敏度提高了四个数量级,比荧光基团作标记物所建立的均相分析方法更加灵敏。另外,本检测方法对单碱基错配的目标链也具有很高的选择性。在本文的第四章,应用线性光散射技术建立了一种均相溶液中检测核酸单碱基多态性的分析方法。实验发现,当单链寡聚核苷酸修饰的金纳米粒子与完全匹配的目标链混合后,探针链与目标链形成的双螺旋结构可以引起金纳米粒子的非交联性聚集,使溶液的光散射强度增强。当目标链与探针链仅在端基有一对碱基不匹配时,金纳米粒子仍呈单分散状态,溶液的光散射强度不发生变化。基于这种现象建立的DNA检测方法,可以使检测限达到1pmol／L,其灵敏度比荧光检测方法提高了三个数量级.,通过在模板链上进行的引物链的单碱基延伸反应,设计相应的探针链修饰金纳米粒子,可以用光散射检测技术对模板上的任何位置的单碱基进行检测,所建立的检测方法,在不经PCR循环放大的情况下,可以对pmol／L含量的DNA上的任何位置的单碱基进行特异性非常好准确分析。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第1章前言  11-29
  1.1 引言  11-12
  1.2 纳米粒子概述  12-13
  1.3 纳米粒子在DNA杂交分析中的应用  13-21
    1.3.1 基因探针  13-15
    1.3.2 纳米粒子在核酸分析中的应用  15-21
  1.4 纳米粒子在免疫分析中的应用  21-29
    1.4.1 蛋白质的化学组成、结构特征与功能  21-23
    1.4.2 免疫分析基础  23
    1.4.3 抗原、抗体及其反应  23-26
    1.4.4 重要的标记免疫分析方法  26
    1.4.5 纳米粒子作探针在免疫分析中的应用  26-29
第2章基于金纳米粒子的聚集结合光散射技术发展的均相免疫分析  29-43
  2.1 引言  29-30
  2.2 实验部分  30-32
    2.2.1 仪器与试剂  30-32
    2.2.2 金纳米粒子的制备与标记  32
    2.2.3 免疫分析步骤  32
  2.3 结果和讨论  32-42
    2.3.1 光散射的光谱特性  32-34
    2.3.2 pH值的影响  34-35
    2.3.3 离子强度对免疫反应的影响  35-36
    2.3.4 反应时间对免疫反应的影响  36-37
    2.3.5 方法的特异性  37-39
    2.3.6 免疫分析方法的动态范围、精密度和检出限  39-41
    2.3.7 样品测定  41-42
  2.4 本章结论  42-43
第3章基于金纳米粒子交联聚集的均相DNA杂交光散射分析  43-52
  3.1 引言  43-44
  3.2 实验部分  44-47
    3.2.1 仪器与试剂  44-46
    3.2.3 杂交分析步骤  46-47
  3.3 结果与讨论  47-50
    3.3.1 金纳米粒子聚集体的光散射性质  47-48
    3.3.2 NaCl的浓度对杂交反应的影响  48-49
    3.3.3 DNA检测方法的特异性  49-50
    3.3.4 线性范围与检出限、精密度  50
  3.4 本章结论  50-52
第四章基于金纳米粒子非交联性聚集的均相DNA单碱基多态性线性光散射分析  52-65
  4.1 引言  52-53
  4.2 实验部分  53-57
    4.2.1 仪器与试剂  53-54
    4.2.2 金纳米粒子的制备与标记  54-55
    4.2.3 引物链的单碱基延伸  55-56
    4.2.4 金纳米粒子聚集体的光散射谱图测试  56-57
  4.3 结果与讨论  57-64
    4.3.1 金纳米粒子和聚集体的光散射谱图  57
    4.3.2 NaCl对金纳米粒子聚集反应的影响  57-59
    4.3.3 方法的动态范围、检出限和精密度  59
    4.3.4 匹配链和端基错配链诱导的纳米金粒子光散射谱图  59-61
    4.3.5 DNA单碱基多态性的检测  61-64
  4.4 本章结论  64-65
参考文献  65-78
附录在学其间完成的学术论文和参加的科研项目  78-79
致谢  79

免疫和DNA杂交分析中纳米粒子线性光散射探针的研究

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