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灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性机制研究

作　者: 刘大伟
导　师: 段玉玺
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 灰皮支黑豆 大豆胞囊线虫 抗性机制 蛋白质组学 数字基因表达谱
分类号: S435.651
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


大豆胞囊线虫病（Soybean Cyst Nematode, SCN）是大豆生产中的重要病害之一。从世界范围来看,大豆胞囊线虫病的为害和蔓延日趋加重。本论文系统地从防御酶系的活性、次生代谢物质的含量、膜脂过氧化作用、光合作用、物质代谢等角度研究了我国特有的抗病品种灰皮支黑豆（ZDD2315）抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生理生化机制；并首次利用抗病品种灰皮支黑豆与辽宁省的主栽品种辽豆15配制杂交组合,通过分离群体分组分析法（Bulked Segregant Analysis, BSA）建立了F4代抗、感池,采用双向电泳技术和质谱分析技术,寻找与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的差异蛋白；同时利用新一代高通量测序技术,筛选抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15在大豆胞囊线虫3号生理小种侵染前后差异表达的基因,揭示灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的分子机制。主要研究结果如下：1.明确了抗病品种灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性不具有抗侵入的作用,而具有抗发育的作用。利用冰冻切片技术研究抗、感品种灰皮支黑豆和辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后根部的组织病理学反应,明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的组织结构抗性。2.明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生化机制。抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后,根内多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶的活性均表现升高,并且在灰皮支黑豆中各种防御酶系的活性高峰出现的较早,根内的总酚、类黄酮含量也都表现增加,但在灰皮支黑豆中的含量后达到峰值。3.明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生理机制。抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后,辽豆15的细胞膜受到了严重的伤害,根内丙二醛（MDA）的含量显著增加,电解质大量外渗,根内可溶性糖的含量与对照相比显著增加,可溶性蛋白的含量也明显增加,叶片的叶绿素含量明显降低；而灰皮支黑豆的细胞膜受损程度较轻,根内丙二醛（MDA）的含量虽有少量增加但与对照相比差异不大,电解质少量外渗,根内可溶性糖的含量低于辽豆15,可溶性蛋白的含量却高于辽豆15,叶片的叶绿素含量无明显变化。4.利用BSA法成功构建了灰皮支黑豆（（?））和辽豆15（（?））杂交后代F4抗、感池材料,通过双向电泳获得了抗、感池的2-DE图谱,在凝胶上各检测到近400个蛋白点,对差异表达的27个蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定,获得了这27个蛋白点的肽质量指纹图谱（PMF）,通过Mascot数据库搜索比对,共鉴定出了16个蛋白点,其中仅在抗病池特异表达的蛋白点有hypothetical protein SORBIDRAFT04g012541 （Spot No.7）, predicted protein （Spot No.195）, ATPase alpha subunit （Spot No.224）, homeobox-like protein （Spot No.243）;仅在感病池特异表达的蛋白点有unknown （Spot No.14）;抗病池中表达量上调2倍以上的蛋白点有unknown （Spot No.53,71,284）, hypothetical protein SORBIDRAFT04g012541 （Spot No.116）, trypsin inhibitor p20 （Spot No.117）, Xylem serine proteinase 1 precursor, putative （Spot No.118）, triosephosphate isomerase （Spot No.173,187）, caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase 2 （Spot No.204）;抗病池中表达量下调2倍以上的蛋白点有putative RNA polymerase III （Spot No.296）, ATP synthase beta chain （Spot No.340）.5.利用RT-PCR技术分别获得了灰皮支黑豆573bp的胰蛋白酶抑制剂基因的序列和848bp的咖啡酰辅酶A甲基转移酶（CCoAOMT）基因的序列,同时利用实时荧光定量PCR技术（Real-Time Quantitative PCR）明确了抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后根内胰蛋白酶抑制剂基因的变化规律：大豆胞囊线虫侵染后,胰蛋白酶抑制剂基因在灰皮支黑豆根内的相对表达量始终高于辽豆15,并且在大豆胞囊线虫侵染后25d时灰皮支黑豆根内的胰蛋白酶抑制剂基因的相对表达量达到最高值。6.利用新一代高通量测序技术对灰皮支黑豆和辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后的基因表达谱进行分析,筛选出受大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫诱导表达的差异基因,灰皮支黑豆受大豆胞囊线虫胁迫诱导上调表达的差异基因有389个,下调表达的差异基因有344个；辽豆15豆受大豆胞囊线虫胁迫诱导上调表达的差异基因有222个,下调表达的差异基因有691个。这些差异表达的基因涉及激素应答、转录因子、蛋白激酶、热激蛋白、防御酶系、PR蛋白等方面。

全文目录


摘要  11-13
Abstract  13-16
前言  16-18
第一章 文献综述  18-48
  1.1 大豆胞囊线虫病的研究进展  18-25
    1.1.1 大豆胞囊线虫病的发现与分布  18-19
    1.1.2 大豆胞囊线虫病的危害与症状  19
    1.1.3 大豆胞囊线虫的寄主范围与生活史  19-21
    1.1.4 大豆胞囊线虫生理小种的鉴别模式与分布  21-25
  1.2 大豆抗大豆胞囊线虫的抗病育种及抗病基因的研究进展  25-31
    1.2.1 大豆抗大豆胞囊线虫的抗源筛选  25-26
    1.2.2 大豆抗大豆胞囊线虫的抗病育种  26-27
    1.2.3 大豆抗大豆胞囊线虫的抗病基因的研究进展  27-31
  1.3 大豆抗大豆胞囊线虫病的抗性机制  31-39
    1.3.1 根系分泌物对大豆胞囊线虫卵孵化的影响  31-32
    1.3.2 寄主对大豆胞囊线虫侵入的细胞及组织病理学反应  32-33
    1.3.3 大豆抗大豆胞囊线虫病的生理生化机制  33-37
    1.3.4 抗病品种对大豆胞囊线虫发育的影响  37-38
    1.3.5 大豆抗大豆胞囊线虫病的遗传机制  38-39
  1.4 蛋白质组学及其在植物病理学中的应用  39-46
    1.4.1 蛋白质组学的产生与应用  39-40
    1.4.2 蛋白质组学的研究内容与技术手段  40-43
    1.4.3 蛋白质组学在植物病理学中的应用  43-45
    1.4.4 蛋白质组学的前景与展望  45-46
  1.5 基因表达谱研究概况  46-48
第二章 灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的组织抗性  48-54
  2.1 材料与方法  48-50
    2.1.1 供试材料  48-49
    2.1.2 试验方法  49-50
  2.2 结果与分析  50-52
    2.2.1 抗感品种根内侵入二龄幼虫的数量变化  50-51
    2.2.2 抗感品种根内大豆胞囊线虫的发育动态变化  51-52
    2.2.3 抗感品种受大豆胞囊线虫侵染后的组织病理学反应  52
  2.3 结论与讨论  52-54
第三章 灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生化机制  54-64
  3.1 材料与方法  54-58
    3.1.1 供试材料  54-55
    3.1.2 试验方法  55-58
  3.2 结果与分析  58-62
    3.2.1 大豆胞囊线虫侵染对大豆根内防御酶系活性的影响  58
    3.2.2 大豆胞囊线虫侵染对大豆根内几丁质酶活性的影响  58-59
    3.2.3 大豆胞囊线虫侵染对大豆根内次生代谢物质含量的影响  59-62
  3.3 结论与讨论  62-64
第四章 灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生理机制  64-75
  4.1 材料与方法  64-69
    4.1.1 供试材料  64-65
    4.1.2 试验方法  65-69
  4.2 结果与分析  69-74
    4.2.1 大豆胞囊线虫侵染对大豆细胞膜系统的影响  69-70
    4.2.2 大豆胞囊线虫侵染对大豆幼苗光合作用的影响  70
    4.2.3 大豆胞囊线虫侵染对大豆根内物质代谢的影响  70-74
  4.3 结论与讨论  74-75
第五章 大豆胞囊线虫胁迫下大豆根系差异蛋白质组学研究  75-95
  5.1 材料与方法  75-84
    5.1.1 供试材料  75-79
    5.1.2 试验方法  79-84
  5.2 结果与分析  84-94
    5.2.1 杂交后代抗、感池的构建  84
    5.2.2 抗、感池大豆根系双向电泳图谱的比较  84-85
    5.2.3 抗、感池差异蛋白点的质谱鉴定  85-94
  5.3 结论与讨论  94-95
第六章 大豆胞囊线虫抗性相关基因的克隆  95-110
  6.1 材料与方法  95-103
    6.1.1 供试材料  95-97
    6.1.2 试验方法  97-103
  6.2 结果与分析  103-108
    6.2.1 大豆总RNA的提取  103-104
    6.2.2 胰蛋白酶抑制剂基因的扩增结果  104-105
    6.2.3 咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因的扩增结果  105-106
    6.2.4 SCN侵染前后胰蛋白酶抑制剂基因相对表达量分析  106-108
  6.3 结论与讨论  108-110
第七章 大豆胞囊线虫胁迫下大豆数字化基因表达谱研究  110-132
  7.1 材料与方法  110-116
    7.1.1 供试材料  110-111
    7.1.2 试验方法  111-116
  7.2 结果与分析  116-126
    7.2.1 RNA样品的质量检测  116
    7.2.2 表达谱测序评估  116-118
    7.2.3 基因表达注释  118-121
    7.2.4 差异表达基因的筛选  121-125
    7.2.5 反义链的转录分析  125
    7.2.6 新转录本的检测  125
    7.2.7 GO功能显著性富集分析  125-126
    7.2.8 Pathway显著性富集分析  126
  7.3 结论与讨论  126-132
第八章 结论与讨论  132-135
  8.1 明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的抗病类型  132
  8.2 防御酶系活性变化与灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫密切相关  132
  8.3 次生代谢物质含量变化与灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫密切相关  132-133
  8.4 膜脂过氧化作用、物质代谢与灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫密切相关  133
  8.5 利用蛋白质组学技术筛选与灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫相关的蛋白质  133-134
  8.6 利用RT-PCR技术获得了灰皮支黑豆的KTI、CCoAOMT基因的序列  134
  8.7 利用基因表达谱筛选灰皮支黑豆在大豆胞囊线虫胁迫下差异表达基因  134
  8.8 展望  134-135
参考文献  135-145
附录  145-151
致谢  151-153
攻读学位论文期间发表文章  153-155
论文图表统计  155

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 大豆病虫害
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