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中华鳖肠道、脾脏和脑垂体的主要功能细胞学研究

作　者: 包慧君
导　师: 陈秋生
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 中华鳖肠道脾脏脑垂体细胞学
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

中华鳖是我国重要的水产养殖动物,具有很高的营养价值和药用价值。在生物学方面,中华鳖属于爬行纲,具有冬眠现象和变温特点,其消化、免疫和内分泌等的生理活动和代谢过程有别于其它动物。随着我国人工饲养的规模不断扩大,中华鳖一些传染病的流行和扩散也越来越严重。以往,关于中华鳖的试验研究较多都集中在与疾病相关领域,对于其特殊结构的基础性研究,资料比较缺乏。本文以具有我国特色的中华鳖为模式动物,详细研究了其代表性的器官组织：消化系统的肠道,免疫系统的脾脏,内分泌系统的脑垂体等的细胞学特征,并分析了其功能意义。论文主要内容包括鳖肠道黏膜机械屏障和免疫屏障细胞组成和结构特征；Cajal间质细胞在肠道的分布差异和超微结构特征；脾脏椭球高内皮毛细血管的发现及淋巴细胞迁移的细胞学基础；腺垂体内分泌细胞超微结构及其季节性变化。从以上三个方面,阐述了中华鳖的细胞特征及其意义,为进一步研究其生理功能、免疫机能、冬眠期和非冬眠期的生理周期变化奠定了理论的基础,同时为人工饲养、疾病预防和治疗方面提供科学依据。试验Ⅰ中华鳖肠道上皮内黏膜屏障的结构与细胞特征通过光镜和电镜观察正常情况下,中华鳖肠道上皮内黏膜屏障的结构特征,统计分析了中华鳖不同月份肠免疫屏障的主要成分—上皮内淋巴细胞(IEL)在小肠和大肠的分布规律。结果显示：小肠黏膜上皮为单层柱状或假复层柱状上皮。黏膜上皮顶部的上皮细胞之间排列紧密,有发达的紧密连接,中间连接和桥粒等细胞连接复合体。黏膜上皮中部和基底部的上皮细胞之间也存在桥粒和嵌合连接。小肠黏膜上皮大多数上皮细胞胞质内含有少量线粒体,少量上皮细胞胞质含有丰富线粒体和脂滴。大肠黏膜上皮为假复层柱状上皮,所有的上皮细胞胞质内未见脂滴分布。黏膜上皮顶部的上皮细胞排列紧密,而中部和基底部的上皮细胞排列疏松,细胞之间的间隙宽大而明显。许多黏液细胞散在分布于整个肠道的黏膜上皮细胞之间,有的细胞胞质内黏液颗粒电子密度低,而有的电子密度高。黏液细胞分泌的黏液覆盖于肠黏膜表面。肠黏膜上皮内缺乏微皱褶细胞。肠道黏膜上皮细胞之间存在直径为1-7gm的通道,有时可见通道内有淋巴细胞分布。IEL(直径4-9μm)位于肠道黏膜上皮细胞之间,并在它们之间伸出伪足,显示出IEL具有迁移趋势。肠腔内可见完整的游离淋巴细胞。在上皮细胞之间发现了浆细胞的分布,一般位于肠道黏膜上皮的中部和基底部,浆细胞有两种形态：一种粗面内质网为扩张状态,另一种是扁平囊状。IEL细胞数量从5月、9月到12月逐渐减少。以上试验结果提示,鳖肠道黏膜上皮具有黏膜屏障功能。上皮细胞及其紧密连接复合体、黏液细胞分泌的黏液构成机械屏障；浆细胞、IEL和通道构成免疫屏障。鳖肠道黏膜免疫细胞分布也受季节影响。试验Ⅱ中华鳖肠黏膜免疫屏障中CD3+T、CD22+B淋巴细胞的分布采用免疫细胞化学SABC法,观察中华鳖肠道免疫屏障内CD3+T、CD22+B淋巴细胞的分布特征,统计并分析了中华鳖各肠段CD3+T淋巴细胞、CD22+B淋巴细胞的分布规律。结果发现：CD3+T淋巴细胞主要分布在固有膜内,少量见于黏膜上皮内。而大部分CD22+B淋巴细胞分布于黏膜上皮,固有膜内却少见。在上皮内,CD3+T淋巴细胞在小肠从前到后依次递增,小肠后段数量最多；而在大肠CD3+T淋巴细胞依次递减。在固有膜内,CD3+T淋巴细胞在小肠中段密度最高,而在大肠依次递减。上皮内,固有膜内CD3+T淋巴细胞各肠段相比,大部分肠段之间差异显著。固有膜CD3+T淋巴细胞数量是上皮内的3.11倍,小肠CD3-T淋巴细胞数量是大肠的2倍。对于CD22+B淋巴细胞而言,在上皮内,CD22+B淋巴细胞在小肠后段数量最多,而在大肠从前到后逐渐减少；在固有膜,CD22+B淋巴细胞从小肠前到小肠后段依次减少,在大肠依次降低。上皮内CD22+B淋巴细胞各肠段相比,大部分肠段之间差异不显著,固有膜内CD22+B淋巴细胞在各肠段之间没有显著差异。上皮内CD22+B淋巴细胞数量是固有膜的7.99倍,小肠CD22+B淋巴细胞数量是大肠的1.75倍。以上试验结果说明鳖肠道各段免疫屏障中T、B淋巴细胞的分布存在差异,提示它们在肠道黏膜免疫应答中发挥着不同的生物学作用。试验Ⅲ中华鳖肠道S-100蛋白免疫细胞化学反应研究应用免疫组织化学技术,研究了S-100蛋白阳性细胞在中华鳖肠道的分布规律。结果显示：S-100蛋白阳性细胞可以分为两种类型：第一种类型S-100阳性细胞形态不规则,细胞突起粗细长短不一,主要分布于小肠固有膜和黏膜下层,大肠内几乎没有阳性细胞分布。第二种类型S-100蛋白阳性细胞分为双极和星形细胞。双极S-100蛋白阳性细胞突起有的长,有的短。它们分布于小肠和大肠的黏膜下层和环形肌之间,环形肌内,环形肌和纵形肌之间,大肠的黏膜下层。星形S-100蛋白阳性细胞仅分布于大肠前段固有膜,这些细胞含有多个突起,突起之间相互交织在一起形成网络状结构。S-100蛋白是树突状细胞的特异性抗体,但在Cajal司质细胞、神经胶质细胞也有表达。根据形态和分布位置,本实验第一种类型S-100蛋白阳性细胞为树突状细胞,第二种类型S-100蛋白阳性细胞可能是Cajal间质细胞或神经胶质细胞。目前研究认为,树突状细胞具有抗原呈递作用,Cajal间质细胞是肠道蠕动的起搏点,神经胶质细胞可以维护肠黏膜上皮完整性。因此,推测树突状细胞参与的免疫屏障功能主要在鳖小肠,Cajal间质细胞和神经胶质细胞分别具有调节肠道运动和肠黏膜屏障功能。试验ⅣCajal间质细胞在中华鳖肠道的分布差异和超微特征本文应用c-Kit免疫细胞化学技术和透射电镜研究了Cajal间质细胞(ICC)在中华鳖肠道中的分布和超微结构特征。c-Kit免疫细胞化学反应显示,Cajal间质细胞分为双极和星形细胞。双极c-Kit+ICC细胞突起有的长,有的短或不明显。这些细胞分布于大肠黏膜下层,小肠和大肠的黏膜下层与环肌层之间、环形肌内、环形肌和纵形肌之间、浆膜。在黏膜下层,双极c-Kit+ICC围绕血管分布。在黏膜下层与环形肌之间,环形肌和纵形肌之间,呈线形或呈簇分布,有时围绕在血管周围。在环形肌内,双极c-Kit+ICC围绕在血管周围或与平滑肌细胞平行分布。在浆膜内,双极c-Kit+ICC散在分布。星形c-Kit+ICC细胞只分布在大肠固有膜内,这些细胞具有多个突起,突起之间相互交织形成网状结构,主要围绕在血管周围分布。电镜下,双极和星形ICC细胞胞质内含有线粒体,膜内陷小泡,粗面内质网和多个不规则的胞浆突起。ICC细胞与ICC细胞之间、ICC细胞与神经、ICC细胞与平滑肌细胞之间具有缝隙连接。以上试验结果提示中华鳖肠道ICC细胞具有独特的分布特点和超微结构,其形态特点与其在维护肠道蠕动中的重要作用相一致。试验V中华鳖脾脏椭球高内皮毛细血管的发现及淋巴细胞迁移的细胞学基础本文应用光镜和电镜等技术,对中华鳖脾脏白髓组织结构进行了研究,发现中华鳖脾脏椭球血管不同于其它动物,其血管属于高内皮毛细血管,内皮细胞呈高柱状或立方形,相当于哺乳动物高内皮微静脉。脾脏内存在血-脾屏结构,一方面可以阻止外来异物抗原(碳粒)进入椭球周围淋巴鞘(PELS),另一方面可以形成特殊临时性通道,允许淋巴细胞在其中迁移,到达PELS.通道结构是由网状细胞、网状纤维、迁移细胞(淋巴细胞、巨噬细胞、红细胞)、支持细胞、椭球相关细胞、通道共同构成的复合结构。它们形成了一个有利于淋巴细胞运动的微环境。本试验发现淋巴细胞迁移过程如下：椭球高内皮毛细血管内皮细胞之间形成通道,淋巴细胞沿着通道,穿过椭球高内皮毛细血管基膜,到达椭球；淋巴细胞在支持细胞及其突起作用下,沿着通道,从椭球到达PELS外；淋巴细胞与椭球相关细胞及其突起相联系,从PELS外进入PELS。以上试验结果为深入研究爬行动物淋巴细胞归巢提供了细胞学基础。试验Ⅵ中华鳖腺垂体内分泌细胞超微结构及其季节性变化研究采用透射电镜技术对冬眠期和非冬眠期的中华鳖腺垂体中各种内分泌细胞的超微结构进行了观测分析。结果显示,腺垂体主要有5种内分泌细胞：生长激素(GH)细胞、催乳激素(PRL)细胞、促甲状腺激素(TSH)细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞和促性腺激素(GTH)细胞。它们各有其超微结构特征：GH细胞呈圆形或椭圆形,直径为10-12μm；分泌颗粒分布稠密,呈圆形。PRL细胞椭圆形或不规则形,长径为7-9μm,细胞核形状不规则,胞质电子密度高。TSH细胞呈卵圆形或不规则的多角形,直径为8-12μm,细胞核椭圆形,分泌颗粒数量不多,主要分布在细胞周边。ACTH细胞不规则,直径8-10μm,细胞核为椭圆形,分泌颗粒较少。GTH细胞圆形或卵圆形,直径12-15μm,细胞核为圆形或椭圆形,胞质内有大、小两种分泌颗粒。同时,鳖腺垂体中各种内分泌细胞的结构特征和分泌颗粒密度等存在一定的季节性变化。冬眠期,GH细胞胞质内细胞器比非冬眠期明显减少；TSH细胞在非冬眠期数量高于冬眠期；冬眠期内GTH细胞内的分泌颗粒出现融合变大的现象,颗粒直径明显大于非冬眠期,最大的可以达到2μm。PRL细胞和ACTH细胞超微结构没有明显的季节变化。

全文目录

摘要  7-11
ABSTRACT  11-17
前言  17-19
第一部分文献综述  19-71
  第一章肠道黏膜屏障研究进展  19-37
    第一节肠道黏膜屏障概述  19-23
    第二节肠道黏膜机械屏障和免疫屏障形态学研究进展  23-27
    参考文献  27-37
  第二章 Cajal间质细胞研究进展  37-51
    第一节 Cajal间质细胞的形态  37-38
    第二节 Cajal间质细胞的分布  38-39
    第三节 Cajal间质细胞的功能  39-41
    第四节 Cajal间质细胞与胃肠道疾病之间的关系  41
    参考文献  41-51
  第三章高内皮微静脉研究进展  51-59
    第一节 HEV结构特征  51
    第二节 HEV分布  51-52
    第三节 HEV作用  52
    第四节淋巴细胞穿越HEV过程和机制  52-55
    参考文献  55-59
  第四章脊椎动物腺垂体内分泌细胞研究进展  59-71
    第一节脊椎动物腺垂体细胞超微结构研究  59-62
    第二节不同季节对腺垂体内分泌细胞形态的影响  62-64
    参考文献  64-71
第二部分试验研究  71-181
  第五章中华鳖肠道上皮内黏膜屏障的微细结构与细胞特征  71-93
    1 材料与方法  72-73
    2 结果  73-83
    3 讨论  83-86
    参考文献  86-93
  第六章中华鳖肠黏膜免疫屏障中CD3~+T、CD22~+B淋巴细胞的分布  93-111
    1 材料与方法  94
    2 结果  94-102
    3 讨论  102-104
    参考文献  104-111
  第七章中华鳖肠道S-100蛋白免疫细胞化学反应研究  111-127
    1 材料与方法  112
    2 结果  112-118
    3 讨论  118-120
    参考文献  120-127
  第八章 Cajal间质细胞在中华鳖肠道的分布差异和超微特征  127-147
    1 材料与方法  128
    2 结果  128-136
    3 讨论  136-138
    参考文献  138-147
  第九章中华鳖脾脏椭球高内皮毛细血管的发现及淋巴细胞迁移的细胞学基础  147-165
    1 材料与方法  148
    2 结果  148-158
    3 讨论  158-160
    参考文献  160-165
  第十章中华鳖腺垂体内分泌细胞超微结构及其季节性变化研究  165-181
    1 材料与方法  166
    2 结果  166-171
    3 讨论  171-173
    参考文献  173-181
全文总结  181-183
创新点  183-185
附录Ⅰ 常规石蜡切片过程  185-186
附录Ⅱ SABC免疫组织化学的染色方法  186-187
附录Ⅲ Gordon-Sweets氏网状纤维染色法过程  187-188
附录Ⅳ 冰冻切片的制作过程  188-189
附录Ⅴ 硝酸铅法ATP酶染色过程  189-191
论文发表情况  191-193
致谢  193

中华鳖肠道、脾脏和脑垂体的主要功能细胞学研究

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