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牛体细胞核移植重编程研究

作　者: 梁素丽
导　师: 靳亚平
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 核移植钙离子浓度核纤层蛋白 Oct-4基因重编程
分类号: Q813
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

体细胞核移植是将高度分化的体细胞移入去核的卵母细胞内,成功的体细胞核移植需要在很短的时间内消除原有的供体细胞的分化记忆,将供体细胞核重编程为全能的、胚胎化的状态,并接受卵胞质内的信息,表现出一种新的与胚胎发育密切相关的基因表达模式,这其中包括了复杂的表观遗传的改变。已分化的供体细胞在很短的时间内很难完成如此大量的工作,因此也就造成了核移植效率的低下。本文以研究牛体细胞核移植重构胚的重编程为目标,进行了Ca²⁺在牛卵母细胞成熟、体外受精（IVF）、孤雌激活（PA）及核移植（SCNT）胚胎发育过程中的分布规律及其动态变化的研究;探讨了MG-132对重构胚重编程的作用,研究了核纤层蛋白（lamin A/C）在PA、IVF和NT胚胎的表达情况,对比了Oct-4在SCNT和IVF胚胎发育过程中的表达变化。1.南阳牛耳源组织成纤维细胞的培养?以南阳牛耳缘组织为研究材料,体外培养了成纤维细胞,并对其进行了形态学、细胞生长动力学观察、染色体核型和乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的同工酶分析及,作为后续研究的实验材料。2.南阳牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中Ca²⁺分布规律及其动态变化?采用激光扫描共聚焦显微镜对南阳牛卵母细胞成熟、IVF、PA及SCNT胚胎发育过程中Ca²⁺分布规律及其动态变化进行了全面的研究。Ca²⁺在GV期主要分布在卵皮质区域;GVBD期开始向细胞中心扩散;MⅠ期到MII期Ca²⁺均匀分布于整个细胞。Ca²⁺浓度从GV期开始不断上升,MⅠ期时达到最大,随后开始下降。IVF胚胎原核形成前Ca²⁺主要分布在卵皮质区域;原核形成后,Ca²⁺在整个细胞中都分布;随后Ca²⁺均匀分布于整个卵裂球中,至到囊胚期Ca²⁺明显降低,且分布不均匀,Ca²⁺荧光强度有明显的规律性变化;PA胚胎0²4 h Ca²⁺主要分布在卵皮质区;48 h左右时Ca²⁺在整个卵裂球中都有分布,在核区荧光强度稍强;4-细胞、8-细胞、桑葚胚时,Ca²⁺均匀分布于卵裂球中;囊胚时Ca²⁺分布不均匀;整个过程中Ca²⁺荧光强度变化没有明显规律;核移植24 h后Ca²⁺分布于供体细胞并均匀分布于胞质中;2-细胞、4-细胞、8-细胞中Ca²⁺均匀分布于各卵裂球中;桑葚胚和囊胚期Ca²⁺分布不均匀。整个过程Ca²⁺荧光强度变化呈明显的规律性变化。3. MG-132对牛SCNT重构胚重编程的影响?通过MG-132作用于SCNT全过程所得重构胚的发育情况,研究MG-132的作用,并通过免疫组化方法进行验证。5μmol/mL MG-132作用于MI期卵母细胞可有效阻止MPF活性的下降。未添加MG-132组,融合4 h后lamin A/C着色显著,说明染色体凝集不完全,添加组融合4 h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。说明5μmol/mL MG-132就能够促进重构胚的重编程。在SCNT整个过程中添加5μmol/mL MG-132,通过对比lamin A/C在孤雌激活、IVF和核移植重构胚的表达,首先确定lamin A/C可以作为表征重编程的一个因素,其次lamin A/C在核移植重构胚的早期胚胎发育中几乎不表达,8-细胞期开始表达,囊胚期滋养层细胞中正常表达,但内细胞团中表达减弱,这一模式同IVF胚胎的表达模式相近,进一步证明MG-132的添加能够促进重构胚的重编程。4. Oct-4在SCNT重构胚中的表达应用激光扫描共聚焦显微镜研究显示,添加MG-132后,Oct-4在2-4细胞期几乎不表达,到8-16细胞期开始表达;到桑葚胚期和致密桑葚胚期Oct-4强表达;囊胚期Oct-4在内细胞团和滋养层细胞中都持续强表达;孵化囊胚期Oct-4的表达同囊胚期,并未见滋养层细胞中表达明显减弱,这一结果与IVF胚胎中Oct-4起始表达相同,但孵化囊胚期的表达略有不同。以上研究分析了Ca²⁺在牛卵母细胞成熟、IVF、PA和SCNT胚胎中的分布规律及其动态变化,有望通过进一步研究提高核移植激活效率,最终达到提高核移植效率的目的;lamin A/C可以作为表征核移植重编程的一个因素,MG-132用于核移植过程,并对重构胚的重编程具有促进作用,添加MG-132后Oct-4的起始表达与IVF胚胎相同。通过上述研究有望提高核移植效率。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-15
文献综述  15-33
  第一章体细胞核移植技术的研究进展  15-23
    1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展  15-16
    1.2 体细胞核移植研究进展  16-17
    1.3 核移植程序研究  17-23
      1.3.1 供体细胞的选择  18-19
      1.3.2 受体细胞的准备和去核  19-20
      1.3.3 体细胞核移植  20-21
      1.3.4 重构胚激活  21-22
      1.3.5 重构胚培养与移植  22-23
  第二章体细胞核移植重编程  23-33
    2.1 DNA 甲基化及其在胚胎发育中的作用  23-26
      2.1.1 DNA 甲基化  23-25
      2.1.2 DNA 甲基化在胚胎发育中的作用  25-26
    2.2 组蛋白修饰作用  26-28
      2.2.1 组蛋白甲基化  26-27
      2.2.2 组蛋白乙酰化  27-28
    2.3 Ca~(2+)在卵母细胞成熟、激活及胚胎发育中的作用  28-30
      2.3.1 Ca~(~(2+))与卵母细胞成熟  28-29
      2.3.2 Ca~(2+)与卵母细胞激活  29-30
    2.4 核移植过程中核重编程的蛋白酶  30-31
    2.5 核移植重构胚中核纤层蛋白变化  31
    2.6 核移植重构胚中Oct-4 的表达  31-33
试验研究  33-81
  第三章南阳牛耳缘成纤维细胞的体外培养及其生物学特性研究  33-43
    3.1 材料和方法  33-35
      3.1.1 样品来源  33
      3.1.2 主要试剂  33
      3.1.3 主要仪器  33-34
      3.1.4 主要试剂配制  34-35
    3.2 试验方法  35-37
      3.2.1 原代培养  35-36
      3.2.2 传代培养  36
      3.2.3 细胞冻存与复苏  36
      3.2.4 细胞活率计算  36
      3.2.5 生长曲线  36
      3.2.6 染色体分析  36-37
      3.2.7 同工酶酶谱分析  37
    3.3 结果  37-41
      3.3.1 原代和传代细胞形态学观察  37-38
      3.3.2 细胞冻存前及复苏后细胞活率  38
      3.3.3 细胞生长的动态观察  38-39
      3.3.4 细胞染色体分析  39
      3.3.5 细胞同工酶酶谱分析  39-41
    3.4 讨论  41-42
      3.4.1 成纤维细胞的体外培养  41
      3.4.2 染色体分析  41-42
      3.4.3 同工酶分析  42
    3.5 小结  42-43
  第四章Ca~(2+)在牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程的动态变化  43-58
    4.1 试验材料  43-46
      4.1.1 主要试剂  43-44
      4.1.2 主要实验仪器  44
      4.1.3 主要试剂配制  44-46
    4.2 试验方法和设计  46-47
      4.2.1 卵巢的采集  46
      4.2.2 卵母细胞的采集和培养  46
      4.2.3 成熟卵母细胞的孤雌激活及培养  46
      4.2.4 精子获能及体外受精  46
      4.2.5 卵母细胞或胚胎Ca~(2+)的测定  46
      4.2.6 供体细胞准备  46-47
      4.2.7 核移植  47
      4.2.8 核移植胚激活及培养  47
      4.2.9 试验设计及数据分析  47
    4.3 结果  47-55
      4.3.1 卵母细胞发育过程中Ca~(2+)分布  47-49
      4.3.2 体外受精不同时间胚胎Ca~(2+)分布  49-51
      4.3.3 成熟卵母细胞孤雌激活后Ca~(2+)分布  51-53
      4.3.4 体细胞核移植重构胚发育各时期Ca~(2+)分布观察  53-54
      4.3.5 体外胚胎Ca~(2+)浓度对比分析  54-55
    4.4 讨论  55-57
      4.4.1 Ca~(2+)在卵母细胞成熟和激活过程中的作用  55
      4.4.2 Ca~(2+)在卵母细胞成熟过程中的分布  55-56
      4.4.3 Ca~(2+)浓度升高引起卵母细胞激活  56
      4.4.4 体外胚胎Ca~(2+)变化  56-57
    4.5 小结  57-58
  第五章蛋白酶抑制剂MG-132 对牛核移植重构胚重编程的影响  58-73
    5.1 试验材料  59-60
      5.1.1 主要试剂  59
      5.1.2 主要实验仪器  59
      5.1.3 主要试剂配制  59-60
    5.2 试验方法和设计  60-61
      5.2.1 卵母细胞的采集及培养  60
      5.2.2 成熟卵母细胞的孤雌激活  60
      5.2.3 供体细胞的准备  60
      5.2.4 核移植  60
      5.2.5 核移植胚激活及培养  60
      5.2.6 免疫组化  60
      5.2.7 试验设计  60-61
      5.2.8 数据分析  61
    5.3 结果  61-69
      5.3.1 不同浓度MG-132 作用于MⅠ期卵母细胞对孤雌激活胚胎发育的影响  61-62
      5.3.2 MG-132 作用于成熟卵母细胞后对孤雌激活胚胎发育的影响  62-63
      5.3.3 核移植过程中添加5 μmol/mL MG-132 重构胚发育情况  63
      5.3.4 Lamin A/C 在成纤维细胞和融合胚胎中的表达  63-64
      5.3.5 Lamin A/C 在牛孤雌激活胚胎中的表达  64-66
      5.3.6 Lamin A/C 在牛卵母细胞和IVF 胚胎中的表达  66-67
      5.3.7 Lamin A/C 在核移植重构胚中的表达  67-69
    5.4 讨论  69-72
      5.4.1 MPF 在核移植过程中的作用  69
      5.4.2 MG-132 在体细胞核移植中的应用.  69-70
      5.4.3 核纤层的组成和作用  70-71
      5.4.4 Lamin A/C 在不同物种IVF 和SCNT 过程中的表达.  71-72
    5.5 小结  72-73
  第六章 Oct-4 在牛核移植胚胎中的表达.  73-81
    6.1 试验材料  74
      6.1.1 主要试剂  74
      6.1.2 主要实验仪器  74
      6.1.3 主要试剂配制  74
    6.2 试验方法和设计  74-75
      6.2.1 卵母细胞的采集及培养  74
      6.2.2 供体细胞的准备  74
      6.2.3 核移植  74
      6.2.4 核移植胚激活及培养  74
      6.2.5 精子获能及体外受精  74
      6.2.6 免疫组化  74
      6.2.7 试验设计  74
      6.2.8 数据分析  74-75
    6.3 结果  75-78
      6.3.1 Oct-4 在IVF 胚胎中的表达  75-76
      6.3.2 Oct-4 在核移植重构胚中的表达  76-78
    6.4 讨论  78-80
      6.4.1 Oct-4 在核移植过程中的作用  78
      6.4.2 Oct-4 在核移植胚胎的表达  78-80
    6.5 小结  80-81
结论  81-82
创新点  82-83
进一步研究内容  83-84
参考文献  84-99
致谢  99-100
作者简介  100

牛体细胞核移植重编程研究

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