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产双酶恶臭假单胞菌的选育与酶法制备D-pHPG

作　者: 莫章桦
导　师: 刘友全
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: D-对羟基苯甘氨酸 DHase DCase 诱变 固定化 酶促反应
分类号: TQ465
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)是合成p-内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢羟氨苄等的重要中间体,其主要的制备方法包括化学法和生物酶法。其中最安全环保、步骤简单的方法是一菌双酶法。本文所研究的恶臭假单胞菌在其生长代谢过程中能同时产生D-海因酶(DHase)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(DCase),此双酶能将DL-对羟基苯海因一步催化生成D-对羟基苯甘氨酸。本文主要的研究内,容包括：产双酶菌种的验证及中间体N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-pHPG)的制备；紫外(UV)结合硫酸二乙酯(DES)复合诱变选育高产菌株；低能民+注入诱变选育高产菌株；高产变异菌株发酵培养条件的优化；双酶的提取纯化和DHase的固定化；DHase固定化酶与DCase纯化酶两酶一步法制备D-对羟基苯甘氨酸。通过对出发菌株spMF0507的初步验证,确定其发酵20h-50h为对数生长期,最适生长温度为28℃-32℃,产双酶最适温度为28℃-30℃；其最适生长pH为6.5-7.5,产双酶最适pH为7.0-7.5。DHase和DCase在不同的温度和pH下表现出不同的酶活力,其中DHase稳定性较高,而DCase对热不稳定,在高温高pH条件下易失活。通过升温55℃-60℃处理菌悬液30min可使DCase失活而DHase基本保持原活力,把底物DL-pHPH配成6%浓度,与DCase失活的菌悬液等体积混合,控制温度33℃,pH9.0-9.5进行转化反应制备NC-D-pHPG,转化后结晶率达97.9%,制备的NC-D-pHPG纯度为98.5%。采用UV结合DES复合诱变出发菌株spMF0507,选择紫外灯照射30s并结合1.5mg/mL的DES处理20min后再通过20μg/mL5-氟尿嘧啶(5-FU)选择性筛选和发酵摇瓶初筛复筛并通过继代遗传稳定性实验考察,诱变菌spUD0612具有较高的产酶稳定性,其DHase酶活力达1.784U/mL,DCase酶活力达0.865U/mL,分别比出发菌株提高了87.39%和58.420%。用低能N+离子注入对spUD0612菌株进行诱变选育,在注入能量30 KeV,注入剂量为8×1015ions/cm2,真空10-3Pa,电流强度10mA,脉冲8s条件下进行矿注入,通过在含有25μg/mL5-FU的选择培养基上筛选和摇瓶初筛复筛后再通过继代遗传稳定性实验考察,诱变菌spUDN0706具有较高的产酶稳定性,其DHase活力达2.482U/mL,DCase酶活力、达1.253U/mL,分别比出发菌株spUD0612提高了46.69%和53.93%。通过对发酵培养基和发酵控制条件进行优化,确定了在接种量为8%-10%,培养温度为30℃,初始pH为7.5,摇瓶装量为100mL时,高产变异株spUDN0706发酵有较高的生物量和双酶活力。对发酵配方进行正交实验优化后通过综合比较双酶活力,得出最佳发酵培养基配方为：玉米浆2.0%；甲硫乙基海因(10%)3.5%；葡萄糖2.5%; NaCl0.3%; MgSO40.05%; CoCl20.01%; (NH4)2SO40.1%。在新配方和优化的控制条件下进行高产变异株spUDN0706摇瓶发酵, DHase和DCase酶活力分别为2.591U/mL和1.622U/mL,分别比原发酵条件下DHase和DCase酶活力提高了14.04%和28.63%。将高产变异株spUDN0706进行5L自动发酵罐发酵,DHase活力为3.0.78U/mL, DCase活力为1.953U/mL,分别比摇瓶活力提高了18.80%和20.41%。收集高产诱变株spUDN0706发酵液的菌体,采用高压均质机进行破碎,确定了最适匀浆压力为60MPa,最适破碎时间为15min。采用先20%(NH4)2SO4纯化DCase再34%(NH4)2SO4纯化DHase可实现双酶的分离纯化。通过粗酶液絮凝、两级(NH4)2SO4纯化以及经截留量为一万分子量的超滤膜处理,DHase纯化总收率为69.2%,纯化倍数达6.4；DCase纯化总收率为76.4%,纯化倍数达5.45。通过对DHase固定化条件的研究,确定了TJS载体投量为1g：133U,固定化温度、pH、固定化时间分别为25℃、7.5和15h,在此条件下进行DHase的固定化,固定化活力为48.7U/g,酶回收率为34.8%。通过测定不同pH和不同温度下DHase固定化酶及DCase纯化酶的酶活力,DHase固定化酶最适pH为9.5,最适温度为60℃；DCase纯化酶最适pH为7.5,最适温度为40℃。DHase固定化酶对热和酸碱的稳定性均明显优于DCase纯化酶。Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+对DHase固定化酶和DCase纯化酶均有激活作用；Co2+对DHase固定化酶有激活作用而对DCase纯化酶有抑制作用；Fe2+、Zn2+、Hg2+对DHase固定化酶及DCase纯化酶均有抑制作用,其中重金属Hg2+对酶有强烈的抑制作用。DHase固定化酶的半衰期为210d,其表观米氏常数Km为20.14mmol/L; DCase纯化酶半衰期为6d,其表观米氏常数Km为8.40mmol/L。在底物浓度3%,温度38℃,DHase固定化酶投入量5kU/L, DCase纯化酶投入量3kU/L条件下进行多批次转化,固定化酶半衰期在256批以后,每批的转化率和收率均在97%左右。用DHase固定化酶结合DCase纯化酶两酶一步法转化DL-pHPH制备D-pHPG后,经截留量为一万分子量的超滤膜过滤浓缩精制,D-pHPG的含量为99.2%,比旋度为-159.8°,达到了较高的质量水平。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩略词  10-15
1 绪言  15-48
  1.1 产双酶恶臭假单胞菌的形态及代谢生理  15-16
  1.2 D-对羟基苯甘氨酸的研究进展  16-21
    1.2.1 D-pHPG的性质和作用  16
    1.2.2 以D-pHPG为侧链的几种主要药物  16-18
    1.2.3 D-pHPG的应用前景  18-19
    1.2.4 D-pHPG的制备方法  19-21
  1.3 海因酶  21-26
    1.3.1 海因酶的性质  21-22
    1.3.2 海因酶的催化机制  22-24
    1.3.3 海因酶基因工程菌研究  24-26
  1.4 N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶  26-30
    1.4.1 N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的性质  26-27
    1.4.2 DCase的催化机制  27-28
    1.4.3 DCase基因工程菌的研究进展  28-30
  1.5 高产酶菌株的获得方法及发酵工艺  30-32
    1.5.1 海因酶产生菌的筛选  30-31
    1.5.2. DCase产生菌的筛选  31
    1.5.3 两种酶工程菌研究的比较  31-32
  1.6 国内外诱变育种研究现状  32-38
    1.6.1 诱变方法研究现状  32-37
    1.6.2 诱变菌种的筛选  37-38
  1.7 酶的提取及纯化  38
  1.8 酶的固定化及应用  38-46
    1.8.1 常规酶的固定化方法  39-41
    1.8.2 固定化方法的比较及固定化酶的优点  41-42
    1.8.3 新型的固定化技术  42-44
    1.8.4 多酶系统的共固定化  44
    1.8.5 固定化酶在医药及化工等行业的应用  44-46
  1.9 本论文的工作目的、意义和研究内容  46-48
    1.9.1 目的和意义  46
    1.9.2 论文工作内容及工艺流程  46-48
2 产双酶菌种的验证及N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸的制备  48-62
  2.1 材料与方法  48-52
    2.1.1 实验仪器  48
    2.1.2 主要实验试剂  48
    2.1.3 菌种  48
    2.1.4 培养基  48
    2.1.5 相关溶液  48-49
    2.1.6 实验方法  49-52
  2.2 结果与讨论  52-60
    2.2.1 菌种的纯化及菌体形态观察  52
    2.2.2 生长曲线的绘制  52-53
    2.2.3 产双酶菌种的验证  53-54
    2.2.4 培养温度对发酵生物量及产酶活力的影响  54
    2.2.5 初始pH对发酵生物量及产酶活力的影响  54-55
    2.2.6 温度对双酶活力的影响  55-56
    2.2.7 pH对双酶活力的影响  56-58
    2.2.8 菌体与底物的适当配比  58
    2.2.9 NC-D-pHPG(中间体)的提取  58-60
  2.3 本章小结  60-62
3 紫外结合硫酸二乙酯复合诱变选育高产菌株  62-74
  3.1 材料与方法  62-66
    3.1.1 实验仪器  62
    3.1.2 主要实验试剂  62
    3.1.3 菌种  62
    3.1.4 培养基  62-63
    3.1.5 相关溶液  63
    3.1.6 实验方法  63-66
  3.2 结果与讨论  66-73
    3.2.1 UV结合DES复合诱变的致死率  66
    3.2.2 UV结合DES复合诱变的突变率  66-68
    3.2.3 5-FU的浓度确定  68-69
    3.2.4 突变菌株的筛选结果  69-70
    3.2.5 突变菌株遗传稳定性考察  70-73
  3.3 本章小结  73-74
4 低能N~+注入诱变选育高产菌株  74-85
  4.1 材料与方法  74-76
    4.1.1 实验仪器与设备  74
    4.1.2 主要实验试剂  74
    4.1.3 菌株  74
    4.1.4 培养基  74-75
    4.1.5 相关溶液  75
    4.1.6 实验方法  75-76
  4.2 结果与讨论  76-84
    4.2.1 不同能量和不同剂量N~+离子注入诱变的存活率  76-77
    4.2.2 N~+离子注入诱变的突变率  77-80
    4.2.3 突变菌株的诱变及筛选结果  80-81
    4.2.4 突变菌株遗传稳定性考察  81-84
  4.3 本章小结  84-85
5 高产变异株spUDNO706发酵培养条件的优化  85-101
  5.1 材料与方法  85-88
    5.1.1 实验仪器与设备  85
    5.1.2 主要实验试剂  85
    5.1.3 菌种  85
    5.1.4 培养基  85-86
    5.1.5 相关溶液  86
    5.1.6 实验方法  86-88
  5.2 结果与讨论  88-100
    5.2.1 不同碳源的测评结果与分析  88
    5.2.2 不同氮源的测评结果与分析  88-89
    5.2.3 不同诱导剂的测评结果与分析  89
    5.2.4 接种量对菌体的生长及产酶活力的影响  89-90
    5.2.5 培养温度对菌体生长及产酶活力的影响  90-92
    5.2.6 初始pH值对菌体生长及产酶活力的影响  92-93
    5.2.7 摇瓶装量对菌体生长及产酶活力的影响  93-94
    5.2.8 发酵培养基的正交实验结果与分析  94-97
    5.2.9 优化发酵条件下摇瓶发酵验证高产诱变株产双酶水平  97-98
    5.2.10 高产诱变株spUDNO706在5L自动发酵罐的发酵结果  98-100
  5.3 本章小结  100-101
6 双酶的提取纯化和DHase的固定化  101-117
  6.1 材料与方法  101-106
    6.1.1 实验仪器  101
    6.1.2 主要实验试剂  101
    6.1.3 菌种  101
    6.1.4 培养基  101-102
    6.1.5 相关溶液  102
    6.1.6 实验方法  102-106
  6.2 结果与讨论  106-116
    6.2.1 蛋白质的测定结果  106
    6.2.2 细胞破碎的压力时间确定  106-107
    6.2.3 纯化结果  107-109
    6.2.4 电泳结果  109-110
    6.2.5 膜分离结果  110-111
    6.2.6 海因酶的固定化条件的确定  111-115
    6.2.7 DHase在优化固定化条件下的固定化酶活力  115-116
  6.3 本章小结  116-117
7 DHase固定化酶与DCase纯化酶两酶一步法制备D-pHPG  117-128
  7.1 材料与方法  117-119
    7.1.1 实验仪器  117
    7.1.2 主要实验试剂  117
    7.1.3 酶  117
    7.1.4 实验方法  117-119
  7.2 结果与讨论  119-126
    7.2.1 pH对DHase固定化酶及DCase纯化酶活性的影响  119-120
    7.2.2 温度对DHase固定化酶及DCase纯化酶活性的影响  120-121
    7.2.3 金属离子对DHase固定化酶及DCase纯化酶活性的影响  121-122
    7.2.4 DHase固定化酶及DCase纯化酶的稳定性考察  122
    7.2.5 DHase固定化酶及DCase纯化酶米氏常数的测定  122-123
    7.2.6 底物浓度对转化率和收率的影响  123-124
    7.2.7 转化温度对转化率和收率的影响  124
    7.2.8 多批次转化反应中酶活力衰减及转化率、收率情况  124-126
    7.2.9 D-pHPG的精制  126
  7.3 本章小结  126-128
8 主要研究结论与研究展望  128-132
  8.1 主要研究结论  128-130
  8.2 创新点  130-131
  8.3 研究展望  131-132
参考文献  132-142
致谢  142-143
攻读学位期间的主要学术成果  143-144

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