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群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜的影响

作　者: 潘琤
导　师: 刘卫红；魏昕
学　校: 南京医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 白色念珠菌生物膜群体感应分子 tyrosol farnesol HTA1 EFG1
分类号: R379
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

白色念珠菌（Candida albicans）是人类口腔内常见的条件致病真菌,生物膜是口腔白色念珠菌最常见的生存方式,在临床感染中有重要意义。近年来许多学者发现群体感应与白色念珠菌生物膜形成及其稳定的维持密切相关。farnesol（法呢醇）和tyrosol（对羟基苯乙醇）是目前已知的白色念珠菌特有的两种群体感应分子,对前者的研究较为深入,而对后者的作用研究较少。本研究应用倒置显微镜和RT-PCR技术观察了两种群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜（90 min）细胞形态以及HTA1和EFG1基因表达的调控,同时通过MTT实验对群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜细胞增殖的作用进行了定量分析,以期为深入研究tyrosol和farnesol的作用机制提供一定的理论依据。第一部分群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜细胞形态的作用【材料和方法】采用含漱法获取白色念珠菌临床株,用RPMI 1640培养液制备浓度为1.0×10⁶/mL的白色念珠菌标准株和临床株标准菌悬液,5%CO₂,37℃条件下以50 mL培养瓶作为载体构建白色念珠菌早期生物膜模型。每株白色念珠菌在生物膜生长过程中,根据作用的群体感应分子不同设置三组处理组和一组对照组:（1）:100μM tyrosol（tyrosol组）;（2）:50μM famesol（farnesol组）;（3）:50μM farnesol+500μM tyrosol（混合处理组）;（4）:无群体感应分子（对照组）。对培养90 min后形成的白色念珠菌早期生物膜在倒置显微镜下进行形态学观察,同时观察无群体感应分子作用时生长48小时的成熟生物膜。【结果】tyrosol组和对照组早期生物膜内均以菌丝相细胞为主;farnesol组和混合处理组早期生物膜中白色念珠菌细胞主要表现为孢子相。培养48 h后白色念珠菌成熟生物膜内包含了菌丝相、孢子相和假菌丝等多种形态的细胞,以菌丝相为主,同时夹杂有细胞外多聚物基质。【结论】Tyrosol对白色念珠菌早期生物膜内细胞的菌丝形成无明显促进作用,而farnesol则对早期生物膜内细胞的菌丝形成表现出明显的抑制作用;当环境中有farnesol存在时,即使高浓度的tyrosol也无法改变其对菌丝形成的抑制作用。第二部分群体感应分子对早期生物膜内白色念珠菌HTA1和EFG1基因表达的调控【材料和方法】将保种的白色念珠菌标准株和临床株复苏,用RPMI1640培养液制备浓度为1.0×10⁶/mL的标准菌悬液,5%CO₂,37℃条件下以50 mL培养瓶作为载体构建白色念珠菌早期生物膜模型。每株白色念珠菌在生物膜生长过程中,根据作用的群体感应分子不同设置三组处理组和一组对照组:（1）:100μM tyrosol（tyrosol组）;（2）:50μM farnesol（farnesol组）;（3）:50μM farnesol+500μM tyrosol（混合处理组）;（4）:无群体感应分子（对照组）。用无菌细胞刮刀刮取生长90 min的早期生物膜,用Trizol试剂盒提取白色念珠菌RNA后进行RT-PCR测试,观察各组组蛋白编码基因HTA1和菌丝形成相关基因EFG1的表达是否有差异。【结果】与对照组相比,tyrosol组白色念珠菌HTA1的表达有所增强（P＜0.05）,EFG1的表达并无明显改变（P＞0.05）;farnesol组HTA1和EFG1的表达均受明显抑制（P＜0.05）;混合处理组HTA1和EFG1的表达的亦受到明显的抑制（P＜0.05）。【结论】tyrosol能提高白色念珠菌早期生物膜内细胞HTA1的转录水平,但对EFG1的表达无明显促进作用,farnesol对白色念珠菌早期生物膜内细胞HTA1及EFG1均有明显抑制作用;当tyrosol和farnesol同时作用时,前者无法改变farnesol对基因表达的下调作用,后者的作用更占优势。第三部分群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜细胞增殖的作用【材料和方法】将保种的白色念珠菌标准株和临床株复苏,用RPMI1640培养液制备浓度为1.0×10⁶/mL的标准菌悬液,5%CO₂,37℃条件下构建白色念珠菌早期生物膜模型。MTT实验采用的生物膜构建载体为96孔细胞培养板,根据作用的群体感应分子不同设置三组处理组和一组对照组:（1）:100μM tyrosol（tyrosol组）;（2）:50μM farnesol（farnesol组）;（3）:50μM farnesol+500μM tyrosol（混合处理组）;（4）:无群体感应分子（对照组）。早期生物膜形成后加入MTT溶液,继续孵育4 h,翻转培养板弃去孔内液体,加入DMSO,振荡10 min,用酶标仪测定490nm处吸光度值(OD₄₉₀),比较不同群体感应分子处理对白色念珠菌早期生物膜细胞增殖生长的影响。【结果】与对照组相比,tyrosol组白色念珠菌早期生物膜内细胞数量无明显差异（P＞0.05）,而farnesol组和混合处理组生物膜内细胞增殖却受到明显抑制（P＜0.05）。【结论】tyrosol对白色念珠菌早期生物膜细胞增殖无显著促进作用;farnesol能够抑制白色念珠菌早期生物膜的细胞增殖,并且这种抑制作用不受环境中高浓度tyrosol的影响。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
正文  13-46
  前言  13-16
  第一部分群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜细胞形态的作用  16-23
    材料与方法  16-19
    结果  19-20
    讨论  20-23
  第二部分群体感应分子对早期生物膜内白色念珠菌HTA1和EFG1基因表达的调控  23-30
    材料与方法  23-26
    结果  26-28
    讨论  28-30
  第三部分群体感应分子对白色念珠菌早期生物膜细胞增殖的作用  30-34
    材料与方法  30-32
    结果  32
    讨论  32-34
  小结  34-35
  参考文献  35-41
  附图  41-45
  缩略语表  45-46
附录  46-53
  个人简历  46-47
  学习成绩  47-48
  就读期间发表文章  48-53
致谢  53-54
综述  54-63
  参考文献  59-63

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