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巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的选育及其PLA降解酶的研究

作　者: 崔婧
导　师: 陈珊
学　校: 东北师范大学
专　业: 微生物
关键词: PLA降解菌菌种鉴定最适产酶条件测定
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着对塑料制品需求的不断增加,带来了不可忽视的能源危机和环境危机。普通塑料在自然环境下几十年都不能被降解,因此开发可降解塑料迫在眉睫。目前开发的可降解塑料主要是聚酯类物质,而其中PLA以其优良的物理化学性能和潜在的成本优势尤受人们的关注。虽然PLA在生产和应用上有比较明显的优势,但是它的生物降解研究比较滞后。因此,本文从PLA降解菌株出发,从菌株的筛选到鉴定,然后测定其最适产酶条件,并进行PLA降解酶的分离纯化。本文主要的工作内容及结果如下:1.对辽宁省抚顺市抚顺石油一厂污水处理车间曝气池中的活性污泥进行PLA降解菌株的筛选。获得了一株能够降解PLA的菌株编号为DS04—W。2.对筛选的DS04—W进行形态学观察,生理生化性质测定,以及16S rDNA序列的测定,最后鉴定该菌为Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)。3.对DS04—W菌降解PLA膜能力的测定,用扫描电镜观察PLA膜降解前后的形态变化。发现在降解过程中透明度逐渐下降,表面变得粗糙,并且肉眼可见细微小泡突起。该结果证明DS04-W菌株确实对PLA膜具有降解能力。4.最适产酶条件的测定,首先从明胶、酪氨酸、酪蛋白、酵母粉、蛋白胨中选出最佳的诱导物,根据实验结果选定为酵母粉;然后通过对温度、pH值、摇床转数、接种量单因素水平进行测定,再进行四因素三水平的正交实验,确定最佳发酵条件为培养时间为48h,培养基起始pH为8.5,摇床转速为200r/min,种子培养基接种量为6%(V/V)。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
一、文献综述  8-15
  1. 聚乳酸的结构  8-9
  2. 聚乳酸的特性  9-10
  3. 聚乳酸的应用  10-11
  4. 聚乳酸的合成  11-12
  5. 聚乳酸的降解  12-14
  6. 本论文研究的目的  14-15
二、实验部分  15-27
  2.1 实验材料  15
    2.1.1 实验菌株  15
    2.1.2 实验药品  15
  2.2 培养基  15-17
    2.2.1 菌种筛选使用培养基  15
    2.2.2 菌种鉴定使用培养基  15-17
    2.2.3 测定酶活所用培养基  17
    2.2.4 诱导培养基  17
  2.3 主要试剂  17-18
    2.3.1 菌种鉴定使用试剂及染色剂  17-18
    2.3.2 SDS—PAGE 凝胶电泳所需试剂  18
    2.3.3 酶活测定所需试剂  18
  2.4 PLA 降解菌株的初筛  18
  2.5 菌种鉴定的方法  18-22
    2.5.1 形态学观察  18-19
    2.5.2 菌种生理生化特性鉴定  19-21
    2.5.3 菌株16S rDNA 鉴定  21-22
  2.6 菌种保藏  22
  2.7 PLA 降解菌酶活力的测定方法  22-23
    2.7.1 PLA 底物的制备  22
    2.7.2 酶活力测定及酶活单位定义  22-23
  2.8 PLA 膜的降解  23-24
    2.8.1 降膜过程中菌体生长情况及pH 的变化  23
    2.8.2 降解前后PLA 膜的变化  23-24
  2.9 诱导物的测定  24
  2.10 最适产酶条件的测定  24-25
    2.10.1 单因素条件测定  24
    2.10.2 正交实验  24-25
  2.11 酶的分离纯化方法  25
    2.11.1 粗酶液的制备  25
    2.11.2 超滤浓缩  25
    2.11.3 冷冻干燥  25
    2.11.4 离子交换层析  25
    2.11.5 分子筛层析  25
  2.12 分子量的测定  25-26
    2.12.1 制胶及电泳  25
    2.12.2 染色及显色  25-26
  2.13 主要仪器  26-27
三、实验结果  27-41
  3.1 菌种的筛选  27
  3.2 菌种鉴定的  27-31
    3.2.1 菌落及菌株形态的观察  27-28
    3.2.2 菌株生理生化特性鉴定  28-29
    3.2.3 16S rDNA 序列的测定以及16S rDNA 序列系统发育分析  29-31
  3.3 D504-W 对PLA 膜的降解  31-32
  3.4 诱导物的测定  32-34
    3.4.1 培养基中明胶含量最适值  32-33
    3.4.2 最佳取样时间的测定  33
    3.4.3 最佳诱导物的测定  33-34
  3.5 以酵母粉为诱导物最适产酶条件的测定  34-39
    3.5.1 最适产酶时间的测定  34
    3.5.2 最适通气量的测定  34-35
    3.5.3 最适接种量测定  35
    3.5.4 最适发酵pH 值的测定  35-36
    3.5.5 最适发酵温度的测定  36-37
    3.5.6 四因素三水平正交实验  37-39
  3.6 PLA 降解酶的分离纯化  39-41
四、讨论  41-42
结论  42-43
参考文献  43-46
致谢  46

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的选育及其PLA降解酶的研究

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