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褪黑素对人骨髓间充质干细胞的作用研究及其机制初步探讨

作　者: 李丽
导　师: 李光来
学　校: 山西医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 骨髓间充质干细胞增殖分化褪黑素褪黑素受体
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的:探讨褪黑素（melatonin,Mel）对人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）增殖分化的作用,以期优化MSCs扩增及向神经元样细分化的实验参数;研究Mel干预的MSCs上Mel受体亚型mRNA的表达情况,为进一步研究和临床应用奠定基础。方法:1.以密度梯度离心结合贴壁培养方法分离MSCs,以含15%胎牛血清L-DMEM培养基进行培养,用流式细胞仪检测CD45、CD44、CD105。2.取传至6代的MSCs,加入不同浓度的Mel,MTT法分别检测24小时、3天、5天细胞的增殖情况;免疫细胞化学法和RT—PCR法检测Mel诱导后24h、3天、5天MSCs表面NSE、GFAP的表达。3.RT—PCR法测定Mel诱导的第6代MSCs上,Mel受体MT₁和MT₂mRNA的表达情况:提总RNA,逆转录,PCR扩增,凝胶电泳,体外基因测序。结果:1.MSCs接种后贴壁良好,折光性强,3天后可见梭状或多边形细胞呈集落状生长,传代迅速,至第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。流式细胞法检测结果为:CD44^-、CD105⁺、CD45^-,证明为较纯的MSCs。2.加入Mel后,实验组MSCs增殖情况和对照组比较,差异不显著。加入Mel后24小时镜下观察见MSCs形态发生变化,宽大扁平的细胞体向胞核收缩,出现双极及多极细胞,有细长突起,3天后变形细胞增多,细长突起相互连接、交织。持续至5天后变形细胞达到高峰。免疫细胞化学法测得诱导后24h、3d、5d Mel高浓度组和低浓度组的NSE染色阳性率较对照组差异显著;各组GFAP染色均呈阴性。3.RT—PeR:提MSCs总RNA,行RT-PeR,琼脂糖凝胶电泳出现一阳性条带,分子量约为370bp,与MT₁引物核苷酸数目（368bp）相符合,320bp附近未出现阳性条带。测序结果示,扩增获得的基因序列与Genbank中人MT₁受体亚型的基因序列相吻合。结论:1.本实验采用密度梯度离心法结合贴壁纯化MSCs,建立了稳定的MSCs培养增值体系,细胞成活率高,贴壁良好,可连续传15代。该采集方法简便易行,体外扩增容易,细胞获得丰富,可推荐为MSCs研究的常规培养方法。2.在Mel诱导下,MSCs可分化为神经元样细胞;Mel对MSCs的增殖无明显作用。3.本实验用RT-PCR技术,初步证实被Mel诱导的MSCs存在MT₁受体mRNA的表达;通过测序,扩增所获得的基因序列与GenBank的人MT₁受体亚型的基因序列相一致,提示Mel干预的MSCs存在MT₁受体mRNA的表达。本实验未检测到亚型MW₂ mRNA的表达,可能因为Mel干预的MSCs不存在MT₂mRNA的表达。

全文目录

英文缩略词  5-6
中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
正文  9-35
  前言  9-10
  第一部分密度梯度与贴壁结合法培养人MSCs及鉴定  10-16
    1.1 材料  10-11
    1.2 方法  11
    1.3 结果  11-14
    1.4 讨论  14-16
  第二部分 Mel对体外培养MSCs增殖及分化的影响  16-27
    2.1 材料  16-17
    2.2 方法  17-21
    2.3 结果  21-25
    2.4 讨论  25-27
  第三部分 MSCs上Mel受体mRNA的表达情况  27-32
    3.1 材料  27
    3.2 方法  27-29
    3.3 结果  29-30
    3.4 讨论  30-32
  结论  32-33
  参考文献  33-35
综述  35-41
  正文  35-38
  参考文献  38-41
个人简介  41-42
致谢  42

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