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乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的功能研究

作　者: 王丹琼
导　师: 赵龙凤
学　校: 山西医科大学
专　业: 传染病学
关键词: 乙型肝炎病毒 PS1TP2 生物信息学酵母双杂交抑制性消减杂交蛋白表达
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒,它是导致肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因。HBV感染致肝细胞损伤机制,很大程度上与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用相关。因此,研究HBV的抗原成分与肝细胞内的蛋白相互作用及其机制,在一定程度上能够阐明HBV的致病机制,为寻找有效的防治HBV的方法提供理论依据。本课题组成员应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,对于HBV前-S1蛋白反式激活作用的靶基因进行筛选,发现了前-S1蛋白可上调一未知功能基因的表达,命名为前-S1蛋白反式激活基因2(PS1TP2),我们将其成功克隆,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能。为研究PS1TP2在HBV感染后病毒致病过程中的作用,从人肝癌细胞中得到PS1TP2基因的全长编码序列,构建与绿色荧光蛋白融合的表达载体pEGFP-C1-PS1TP2,通过基因与荧光蛋白基因融合表达,明确它的亚细胞定位主要在细胞浆。进一步应用酵母双杂交(yeast two-hybrid)技术筛选PS1TP2与白细胞文库中的结合蛋白,包括一些与细胞免疫、信号转导、能量代谢、转录调节相关的基因。将该基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建原核表达重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta诱导进行融合表达。结果在大肠杆菌中获得了高效表达的融合蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该蛋白的分子量约为41kD,这与预测的PS1TP2融合蛋白大小相吻合,并且通过Western-blotting检测证实了PS1TP2的表达。我们以分子生物学技术构建PS1TP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-PS1TP2,以表达质粒pcDNA3.1(-)-PS1TP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建PS1TP2激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,筛选相关的靶基因片段,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆,多聚酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、细胞内信号转导、肿瘤及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测PS1TP2在体内可能存在的调控机制的线索。对该基因功能进行的初步了解,为下一步更加具体的生物学功能、基因表达调控的深入研究开辟道路。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
前言  8-10
实验技术概述  10-12
  1 酵母双杂交技术的原理和应用  10
  2 抑制性消减杂交技术的原理及应用  10-11
  3 蛋白质表达系统  11-12
第一章 PS1TP2的克隆化及生物信息学分析  12-22
  1.1 材料与方法  12-15
  1.2 结果  15-19
  1.3 讨论  19-22
第二章应用酵母双杂交技术筛选PS1TP2蛋白的结合蛋白  22-38
  2.1 PS1TP2蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建及酵母表达  22-28
  2.2 酵母双杂交技术筛选白细胞文库中PS1TP2蛋白的结合蛋白  28-38
第三章 PS1TP2蛋白的反式调节作用的研究  38-49
  3.1 材料与方法  38-45
  3.2 结果  45-47
  3.3 讨论  47-49
第四章 PS1TP2蛋白在大肠杆菌中的表达研究  49-53
  4.1 材料与方法  49-50
  4.2 结果  50-51
  4.3 讨论  51-53
第五章 PS1TP2的亚细胞定位  53-55
  5.1 材料与方法  53
  5.2 结果  53-54
  5.3 讨论  54-55
小结与展望  55-56
参考文献  56-61
附录: 相关综述  61-69
个人简介  69-71
致谢  71

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的功能研究

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