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番茄采后早疫病菌拮抗微生物的筛选、鉴定及发酵条件优化

作　者: 童志丹
导　师: 易有金
学　校: 湖南农业大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 内生菌番茄早疫病菌筛选鉴定发酵条件优化
分类号: TS255.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

番茄作为我国最重要的蔬菜作物,其采后腐烂是困扰番茄采后贮藏的一个大问题。目前控制番茄腐烂最有效的措施是低温贮藏结合化学防腐剂的使用,但低温处理易造成番茄冷害问题,长期使用化学药剂会导致病菌产生抗药性,对人体健康及环境会产生不良影响。生物防治作为控制番茄采后病害的有效措施备受人们关注,因此发掘有效的生防菌进行采后生物防治,其现实意义十分重大。本研究从番茄果实中分离筛选得到15株内生菌株。利用离体筛选方法选出有较强抑菌作用,能明显降低番茄采后早疫病的内生菌株004,通过对其生理生化检测及16S rDNA序列分析进行鉴定。以内生菌株004为拮抗菌株对番茄的贮藏防腐效果进行研究。并对内生菌株004产生的抗菌物质初步提取分析,以及对冷冻干燥时所用保护剂和再水化剂进行研究。主要结果如下：1.通过平板对峙法,筛选出10株内生菌株对番茄早疫病有拮抗效果,其抑菌效果以内生菌株004,抑菌圈为0.4cm。通过内生菌株004小批量贮藏试验发现：内生菌株004能延迟病害发生,烂果率与病情指数明显低于空白组和异菌脲对照组。内生菌株004控制番茄贮藏期早疫病的生物防治效果比化学药剂异菌脲明显,具有积极的现实意义。2.通过对内生菌株004的形态学特征观察、生理生化性状研究及16S rDNA序列分析,确定内生菌株004为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。内生菌株004与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens(HW107808)处于同一分支,相似性99%,其16S rDNA序列全长为1453bp,在GenBank数据库中的注册序列号：HQ840415；同时,为了研究内生菌株004抑菌机理,采用HCl沉淀抗菌物质,利用索氏抽提法对其产生的抗菌物质粗提取,通过HPLC检测分析,该抗菌物质粗提物含有7种主要成分,经试验表明内生菌株004产生的抗菌物质抑制番茄早疫病菌生长,使番茄早疫病菌菌丝断裂、消解、顶端膨大成球状、菌丝体分枝增多、畸形。3.为提高内生菌株004抗菌物质代谢量,对其培养基配方及发酵条件优化。通过试验确定内生菌株004发酵培养基配方为可溶性淀粉10g,酵母膏12g,CaCl2 7g,蒸馏水1000mL；最优发酵培养条件为接种量2%,初始pH 7.0,装液量100mL/250mL,210r/min,30℃振荡培养48h；4.对内生菌株004冷冻干燥的保护剂和复水时再水化剂筛选,结果表明：以10%乳糖为保护剂时,效果最明显内生菌株004的存活率达到80%；以10%乳糖作保护剂时,冷冻干燥后进行复水试验,对不同浓度蛋白胨、蔗糖、脱脂奶粉及0.05mol/L磷酸缓冲液进行再水化剂筛选,结果表明5%蛋白胨作再水化剂效果最显著,存活率达86.7%。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章前言  12-18
  1 果蔬采后病害生物防治  12-16
    1.1 生物防治方法  12-14
      1.1.1 植物提取物生物防治  12-13
      1.1.2 拮抗微生物  13-14
    1.2 生防菌的来源  14-15
      1.2.1 果实表面、裂口、伤口  14
      1.2.2 自然环境  14
      1.2.3 植物内生菌  14-15
    1.3 拮抗微生物作用机理  15-16
      1.3.1 产生抗生素  15
      1.3.2 营养与空间的竞争  15
      1.3.3 寄生作用  15-16
      1.3.4 诱导寄主抗性  16
  2 研究目的与意义  16-18
第二章番茄采后早疫病菌拮抗菌的筛选  18-25
  1 材料与方法  18-20
    1.1 材料  18-19
      1.1.1 样品  18
      1.1.2 主要试剂  18
      1.1.3 培养基  18
      1.1.4 主要设备与仪器  18-19
    1.2 方法  19-20
      1.2.1 番茄早疫病菌分离  19
      1.2.2 拮抗菌分离与筛选  19
      1.2.3 小批量番茄果实贮藏试验  19-20
  2 结果与分析  20-24
    2.1 番茄早疫病菌分离  20-21
    2.2 拮抗菌分离与筛选  21
    2.3 小批量番茄果实贮藏试验  21-24
  3 讨论  24-25
第三章内生菌株004鉴定及抗菌成分初步研究  25-37
  1 材料与方法  25-28
    1.1 材料  25-26
      1.1.1 供试菌株  25
      1.1.2 主要试剂  25
      1.1.3 培养基  25
      1.1.4 主要设备与仪器  25-26
    1.2 方法  26-28
      1.2.1 内生菌株004菌落形态、菌体观察  26
      1.2.2 内生菌株004生理生化鉴定  26
      1.2.3 内生菌株004的16S rDNA分子生物学鉴定  26-27
      1.2.4 无菌发酵滤液制备  27
      1.2.5 内生菌株004胞内外物质抑菌活性测定  27-28
      1.2.6 抗菌物质对番茄早疫病菌菌丝的作用  28
      1.2.7 内生菌株004抗菌物质粗提取及活性检测  28
      1.2.8 反相HPLC检测  28
  2 结果与分析  28-35
    2.1 内生菌株004菌落形态、菌体观察  28-29
    2.2 内生菌株004生理生化特征  29-30
    2.3 内生菌株004 16S rDNA分子生物学鉴定  30-33
    2.4 胞内外物质抑菌活性测定  33
    2.5 内生菌株004抗菌物质对番茄早疫病菌菌丝作用  33-34
    2.6 内生菌株004抗菌物质粗提取及活性检测  34
    2.7 反相HPLC检测  34-35
  3 讨论  35-37
第四章内生菌株004发酵条件优化及冻干保护剂与再水化剂研究  37-52
  1 材料与方法  37-40
    1.1 材料  37-38
      1.1.1 菌种  37
      1.1.2 主要试剂  37-38
      1.1.3 培养基  38
      1.1.4 主要设备与仪器  38
    1.2 方法  38-40
      1.2.1 生长曲线及不同时期发酵滤液抑菌活性的测定  38
      1.2.2 培养基优化  38-39
      1.2.3 发酵条件优化  39-40
        1.2.3.1 培养时间  39
        1.2.3.2 培养温度  39
        1.2.3.3 初始pH值  39
        1.2.3.4 接种量  39-40
        1.2.3.5 转速  40
        1.2.3.6 装瓶量  40
      1.2.4 保护剂的筛选  40
      1.2.5 再水化剂的筛选  40
  2 结果与分析  40-50
    2.1 内生菌株004的生长曲线及不同时期发酵滤液抑菌活性  40-41
    2.2 内生菌株004发酵培养基优化  41-44
      2.2.1 最佳碳源筛选  41-42
      2.2.2 最佳氮源筛选  42-43
      2.2.3 金属离子的筛选  43
      2.2.4 培养基成分正交试验优化  43-44
    2.3 内生菌株004发酵条件优化  44-48
      2.3.1 培养时间对内生菌株004生长和发酵滤液抗菌活性的影响  44-45
      2.3.2 培养温度对内生菌株004生长和发酵滤液抗菌活性的影响  45
      2.3.3 培养基初始pH值对内生菌株004生长和发酵滤液抗菌活性的影响  45-46
      2.3.4 转速对内生菌株004生长和发酵滤液抗菌活性的影响  46
      2.3.5 装液量对内生菌株004生长和发酵滤液抗菌活性的影响  46-47
      2.3.6 接种量对内生菌株004生长和发酵滤液抗菌活性的影响  47-48
    2.4 保护剂的筛选  48-49
    2.5 再水化剂的筛选  49-50
  3 讨论  50-52
结论与创新点  52-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
作者简介  60

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