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苜蓿根瘤菌耐受酸性胁迫的生理、遗传和共生特征研究

作　者: 张学军
导　师: 张磊
学　校: 西南大学
专　业: 微生物学
关键词: 苜蓿中华根瘤菌耐酸系统发育树扫描电子显微镜质子通量
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

紫花苜蓿为豆科苜蓿属多年生牧草,具有生长迅速、饲草产量高、蛋白质含量高、抗逆性强,适应范围广,适口性好等特点,素有“牧草之王”的美誉,在世界各地被广泛栽培利用。苜蓿喜中性或微碱性土壤,pH6～8为宜,在我国北方广泛种植。近年来,随着苜蓿产业化进程加快和我国西部大开发和退耕还林还草工作的进一步深入,紫花苜蓿的种植范围不断扩大,南方苜蓿种植已经成为苜蓿产业化的重要方面。然而,我国南方酸性土壤分布广、面积大,耐酸苜蓿根瘤菌资源缺乏。为此,筛选耐酸苜蓿根瘤菌,对其耐受酸性胁迫的生理、遗传和共生特征进行研究,对促进苜蓿在酸性土壤上的广泛种植十分重要。本研究对筛选到的3株能在pH4.8的YMA固体培养基上正常生长的根瘤菌为研究对象:研究了其生长特性,与紫花苜蓿共生结瘤的影响:通过测定16SrDNA序列,根据所测得的序列构建数值分类树状图,确定其在系统发育学上的地位:对菌体进行扫描电子显微镜分析和在酸性胁迫下的生理特性进行研究;最后进行小区试验,验证其与紫花苜蓿共生状况。研究的主要结果如下:1.对3株根瘤菌在Fahraeus无氮营养液中进行回接结瘤试验,每株分别接种在6个pH梯度(7.0,6.0,5.5,5.2,5.0,4.8)的试管中,每支试管3株幼苗,3次重复。培养30对结瘤数、株高和植株鲜等数据进行统计。结果表明,无论在中性还是在酸性条件下,接种根瘤菌对紫花苜蓿生长作用显著。比较接种不同菌株处理,pH在5.5-7.0,数据规律不明显;pH5.2-4.8,接种菌株91532的苜蓿结瘤数、株高和植株鲜重均明显高于接种91512和91522。2.对各菌株16SrDNA扩增片段测序,91532菌株已经测出,根据所测得的序列构建数值分类树状图,菌株91532与苜蓿中华根瘤菌EF201802相似性达到99.5%。由此可断定91532为1株苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。3.Elizabeth J.和Watkina W.等对耐酸根瘤菌的研究结果表明:扫描电镜下,耐酸菌株在酸性液中细胞将变短小,而酸敏感菌株无明显变化。对耐酸能力相对较强的91532菌株和典型的耐盐碱菌株96489进行扫描电子显微镜分析。结果表明:在中性条件下91532菌体4.平均长度为2.110um,宽度为0.657um,酸性条件下生长的菌体平均长度为1.1887um,宽度为0.6267um.。而96489菌株在中性条件下菌体平均长度为1.539um,平均宽度为0.613um,在酸度为5.5时菌体平均长度为1.539um,平均宽度为0.616um,长度和宽度与中性条件下的几乎一致。在酸性条件下,91532菌体的长度约为中性条件下的1/2,而宽度变化不大。5.为了探讨菌株的耐酸机制,进行了质子通量试验。结果表明:无论是否经过酸(pH5.2)诱导,酸敏感菌株96489和3株耐酸菌株,16Min内pH变化均呈上升趋势,但酸敏感菌株96489未经诱导和诱导处理间的pH变化幅度高于3株耐酸菌株。处理前后各菌株的存活率显示,无论诱导与否,3株耐酸菌株的细胞存活率均达到75%以上;而酸敏感菌株96489经过诱导,其细胞存活率达63%,比未诱导的高32%,差异达到显著水平。酸性诱导使96489产生了ATR反应,使菌体细胞膜有效抵挡外界H~+的侵入,提高菌体在强酸环境中的存活能力。而3株耐酸苜蓿根瘤菌对酸性诱导不起作用,其细胞膜本身具有阻止H~+进入细胞的能力,是长期生存在酸性土壤中形成的稳定遗传性状。6.在缙云山酸性土上种植紫花苜蓿进行田间小区试验,接种情况为:3株耐酸菌株、酸敏感菌株和对照,3次重复,共15个小区。经收获植株并进行相关分析,结果表明:接种根瘤菌(酸敏感和耐酸菌株)对紫花苜蓿生长作用显著,接种耐酸菌株与对照和接种酸敏感菌株比较,株高、根瘤数、植株地上部分鲜重和植株全氮均呈显著相关。对各小区的微生物数量(细菌、真菌、放线菌和根瘤菌)进行测定,分析结果表明,在酸性土壤上种植紫花苜蓿对土壤的微生物定植有显著提高作用;接种耐酸苜蓿根瘤菌,与不接种对照和接种酸敏感菌株对土壤中微生物的定殖差异显著。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章文献综述  11-22
  1.1 紫花苜蓿研究现状  11-13
    1.1.1 紫花苜蓿应用现状  11-12
    1.1.2 紫花苜蓿种植现状  12
    1.1.3 紫花苜蓿接种根瘤菌研究进展  12-13
  1.2 根瘤菌的系统发育研究进展  13-15
    1.2.1 系统分类的研究方法  13-14
    1.2.2 根瘤菌新属新种的确立  14-15
    1.2.3 苜蓿根瘤菌系统发育进展  15
  1.3 紫花苜蓿耐酸研究概述  15-17
    1.3.1 酸性土壤形成原因及我国酸性土壤利用现状  15-16
    1.3.2 紫花苜蓿耐酸研究进展  16-17
  1.4 苜蓿根瘤菌耐酸研究进展  17-22
    1.4.1 苜蓿根瘤菌耐酸菌株的筛选  17-19
    1.4.2 耐酸根瘤菌接种效果  19-20
    1.4.3 根瘤菌耐酸性机理的探讨  20-21
    1.4.4 共生系统对酸、铝的耐受性  21-22
第2章绪论  22-24
  2.1 研究背景和意义  22-23
  2.2 研究范围和内容  23
  2.3 研究的技术路线  23-24
第3章材料与方法  24-33
  3.1 实验材料  24-27
    3.1.1 试验菌株  24-25
    3.1.2 培养基  25-26
    3.1.3 植物材料和供试小区土壤理化等指标  26
    3.1.4 植物营养液  26
    3.1.5 钙溶液  26
    4.1.6 仪器  26-27
  3.2 试验方法  27-31
    3.2.1 回接结瘤  27
    3.2.2 菌株16SrDNA序列测定及同源性分析  27-28
    3.2.4 扫描电子显微镜分析  28-29
    3.2.5 质子通量试验  29-30
    3.2.6 接种耐酸苜蓿根瘤菌对缙云山酸性土壤上紫花苜蓿的生长及土壤微生物数量的影响  30-31
  3.3 测定项目和方法  31-32
    3.3.1 紫花苜蓿无菌幼苗的准备  31
    3.3.2 根瘤菌株的准备  31
    3.3.3 土壤微生物数量和苜蓿根瘤菌数量的测定:稀释平板计数法  31
    3.3.4 土壤理化性质的测定  31-32
    3.3.5 苜蓿根瘤菌生长的测定:  32
    3.3.6 紫花苜蓿植株全氮的测定:  32
  3.4 数据处理  32-33
第4章结果与分析  33-46
  4.1 水培回接结瘤试验  33-35
  4.2 菌株16SrDNA片段测序  35-38
    4.2.1 16S rDNA扩增  35-36
    4.2.2 16S rDNA同源性分析  36-38
  4.3 扫描电子显微镜分析  38-39
  4.4 耐酸苜蓿根瘤菌菌株耐酸特性检验结果  39-41
  4.5 接种耐酸苜蓿根瘤菌对缙云山酸性土壤上紫花苜蓿的生长及土壤微生物数量的影响  41-46
    4.5.1 各小区紫花苜蓿生长苗数的统计和成苗系数的计算  41-42
    4.5.2 接种耐酸苜蓿根瘤菌对紫花苜蓿各农艺性状的影响  42-43
    4.5.3 瘤重与紫花苜蓿上部鲜重、根鲜重、株高和全氮含量的相关分析  43
    4.5.4 不同小区土壤微生物数量统计  43-46
第5章结论与展望  46-49
  5.1 研究结论  46-47
  5.2 展望  47-49
参考文献  49-58
附图  58-59
附录  59-60
致谢  60

苜蓿根瘤菌耐受酸性胁迫的生理、遗传和共生特征研究

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