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铜离子感应基因MAC1转录调控分子机理的研究

作　者: 慕婷
导　师: 朱志兀
学　校: 郑州大学
专　业: 有机化学
关键词: 铜 Mac1 TATA-box元件 Inr元件 Cu/Zn超氧化物歧化酶 Hsp104 热激自由基
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

铜离子在一系列重要的生理过程中起着必不可少的作用；而铜离子在过量的情况下对生命体是有害的；因此生命体必须把其体内的铜离子浓度控制在一个不多不少的范围。作为一个响应Cu离子浓度变化的转录因子,Mac1对酵母细胞的铜离子稳态起着极其重要的作用。通过直接调控一系列高亲和力铜离子转运相关基因,比如CTR1的表达,Mac1使得酵母细胞内的Cu浓度能够保持在一个稳定的水平。然而,目前有关MAC1基因本身是如何被调控的所知甚少。而这了解对我们发现细胞维持铜离子稳态的分子机理是必不可少的。本论文对MAC1基因的转录机理进行了研究。研究发现,MAC1基因启动子区域既缺乏功能性的TATA-box元件,也无功能性Inr的存在,并且MAC1基因ATG上游的DNA序列中似乎并不包含调控MAC1基因表达的启动子。实验发现当MAC1上游序列只剩下5bp时,酵母细胞仍然能需要铜离子存在才能生长的非发酵性培养基上正常生长。这一研究结果表明调控MAC1基因转录的启动子是位于MAC1基因的开放阅读框之内,这是一个有意义的新发现。本论文对一个依赖Cu2+离子才能发挥其生物活性的酶Cu/ZnSOD1进行了研究。本实验室前期实验结果发现铜离子是酵母细胞耐高温必不可少的元素,进一步的研究又发现铜离子是通过作为过氧化物歧化酶Cu/ZnSOD1的辅助因子,从而在细胞耐高温过程中起重要作用的。众多的研究已表明,热激会导致一系列被称作热诱导蛋白质的表达(heat shock protein)。基于实验室前期的研究发现,本论文研究了Cu/ZnSOD1是否影响酵母细胞中最著名的热诱导蛋白HSP104基因的表达。研究结果发现与酵母原株体相比,在sod1Δ的酵母菌株中,热诱导蛋白HSP104基因表达量无论是在热激还是常温条件下都提高了。另外,研究还发现能够清除自由基的乙酰化半胱氨酸(NAC)并不能使在sodlΔ的酵母菌株中HSP104基因表达量降低到酵母原株细胞的水平。这些研究结果表明在sodlΔ的酵母菌株中HSP104基因超正常表达量可能不仅仅是因为细胞丧失了清除自由基的能力。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-8
第一章绪论  8-16
  1.1 生命体中铜离子稳态  8-13
    1.1.1 铜在生命体中的作用  8-9
    1.1.2 铜离子的稳态  9-13
  1.2 铜离子在细胞耐高温中的重要性  13-14
    1.2.1 MAC1激活的依赖于Ctr1吸收的铜离子是细胞耐高温中的重要元素  13
    1.2.2 Cu/Zn超氧化物歧化酶对酵母细胞耐热性的获得是必须的  13-14
  1.3 本论文研究的内容及意义  14-16
    1.3.1 MAC1转录调控机理的研究  14
    1.3.2 Cu,ZnSOD1及乙酰化半胱氨酸(N-Ac)对热诱导蛋白表达的影响  14-16
第二章 MAC1基因的转录调控机理研究  16-37
  2.1 引言  16
  2.2 实验材料及酵母突变株构建  16-28
    2.2.1 实验材料  16-17
    2.2.2 突变株mac1Δ的构建  17-20
    2.2.3 质粒构建  20-27
    2.2.4 MAC1基因启动子突变体酵母菌株构建  27-28
  2.3 实验内容及结果  28-33
    2.3.1 MAC1(-42)突变体中Mac1p正常表达  28
    2.3.2 MAC1基因上游启动子序列分析  28-29
    2.3.3 MAC1基因启动子缺乏经典的TATA-box  29-30
    2.3.4 MAC1基因启动子序列也缺乏Inr启动子元件  30-31
    2.3.5 控制MAC1基因转录的启动子位于MAC1基因的开放阅读框内部  31-33
  2.4 讨论  33-37
第三章 Cu/ZnSOD1及乙酰化半胱氨酸对HSP104表达的影响  37-48
  3.1 引言  37-38
  3.2 实验材料与方法  38-40
    3.2.1 实验中用的培养基及试剂  38-39
    3.2.2 实验中用到的酵母菌株  39
    3.2.3 pRS303-HSP10pr-/acZ质粒的构建  39
    3.2.4 酵母菌株的构建  39
    3.2.5 β-半乳糖苷酶活性测定  39-40
  3.3 实验结果  40-44
    3.3.1 乙酰化半胱氨酸N-Ac在细胞抵抗热激中的重要作用  40-41
    3.3.2 SOD1敲除对HSP104表达的影响  41-42
    3.3.3 乙酰化半胱氨酸(N-Ac)对HSP104表达的影响  42-44
  3.4 讨论  44-48
参考文献  48-53
附录  53-55
  附录A  53-54
  附录B  54-55
致谢  55

铜离子感应基因MAC1转录调控分子机理的研究

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