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小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Real-time PCR检测技术的研究

作　者: 郑亚明
导　师: 周益林
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 小麦白粉菌 Real-time PCR 潜伏侵染病害监测分子流行学
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

由专性寄生真菌Blumeria graminis f. sp. tritici引起的小麦白粉病是小麦生产上的主要病害之一,在我国主要产麦区均有发生。越夏和越冬是该病原菌生活史中的两个重要阶段,病原菌在此期间常处于潜育状态,成为未来生长季重要的侵染源,是病害流行的重要参数。对越夏自生麦苗和越冬麦苗的潜育侵染程度做及时、准确的监测是病害预测预报的重要依据。在对越夏和秋苗调查时,此时病菌往往处于潜伏状态而未表现症状,使我们对病害菌源量的调查和估计不准确。目前多采用的传统方法即人工培养调查病情的方法费时费工,效率很低,难以满足病害预测与防治的需求。本研究建立了Real-time PCR定量测定小麦叶片中潜伏侵染的小麦白粉菌的方法,主要结果如下:设计合成了对小麦白粉菌及小麦的特异性引物,对引物的特异性和灵敏度进行了测定,建立并优化了白粉菌及小麦的SYBR GreenⅠ荧光染料法Real-time PCR反应体系。结果表明,小麦白粉菌及小麦的引物都可与其它麦类病害区分,且小麦白粉菌引物可与小麦叶片区分,均具有特异性;Real-time PCR可检测到的病原菌的DNA最低含量比常规PCR高100倍。在此基础上,利用小麦白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R和Bgt-2F/Bgt-2R分别制作了标准曲线y = -0.2983x+3.0207(r~2 = 0.9909, P = 0.0001),y = -0.2887x+3.4056(r~2=0.9814, P = 0.0001),其中x表示Real-time PCR的Ct值,y表示DNA浓度的对数值。常规PCR与Real-time PCR扩增结果表明引物Bgt-F/Bgt-R比引物Bgt-2F/Bgt-2R灵敏,因此选取引物Bgt-F/Bgt-R进行小麦白粉菌Real-time PCR扩增。同时研究结果还表明小麦DNA对白粉菌Real-time PCR反应无影响;利用引物Wheat-F1/Wheat-R1制作小麦Real-time PCR反应的标准曲线y = -0.3151x+1.9496(r~2 = 0.9968, P = 0.0001),其中x表示Real-time PCR的Ct值,y表示DNA浓度的对数值。分别于2009年3月20日、2010年1月5日和2010年1月22日用不同孢子密度对小麦无菌苗进行了接种试验。接种第1天后,Real-time PCR就能扩增出所有接种密度下小麦叶片中的白粉菌的DNA,最低接种密度为64个孢子/cm2。定义了分子检测病情指数(molecular-detected disease index, MDX),即叶片中白粉菌DNA(μg)/小麦DNA(mg)的比值。结果表明,MDX与实际发病后的病情指数(disease index, DX)呈显著的相关性。由此建立了人工接种小麦白粉菌潜伏侵染Real-time PCR定量检测方法,能通过测定MDX值估计小麦白粉病的侵染和发病情况。用Real-time PCR对田间人工接种和田间自然发生情况下不同地区未显症小麦叶片进行检测,并与实际调查病情指数或取样培养发病的病情指数进行比较,结果表明不同时间不同地块小麦叶片样品(附表1中部分地区)、中国农业科学院植物保护研究所农场人工接种小麦试验田和陕西省眉县槐芽镇地块不同小区小麦叶片样品Real-time PCR检测的MDX与病情指数DX之间有显著的相关性,相关系数分别为0.7201(P = 0.0001)、0.6222(P = 0.0005)和0.6803(P = 0.0001),说明Real-time PCR能够快速检测到田间潜伏侵染的小麦白粉菌,并且可以应用MDX与DX的相关性预测小麦白粉病发生情况,对预测小麦白粉病流行趋势提供了新的手段。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章引言  10-17
  1.1 小麦白粉病概述  10-12
    1.1.1 小麦白粉病发生分布和危害  10
    1.1.2 病害症状  10
    1.1.3 病原菌生物学特性  10-11
    1.1.4 病害侵染循环和生活史  11-12
  1.2 实时荧光定量PCR技术在植物病害流行学中的应用  12-15
    1.2.1 实时荧光定量PCR的原理  12-13
    1.2.2 寄主组织内植物病原菌的定量研究  13-14
    1.2.3 空气中植物病原菌的定量研究  14
    1.2.4 土壤中植物病原菌的定量研究  14
    1.2.5 种子中植物病原菌的定量研究  14-15
    1.2.6 植物病原菌抗药性监测  15
  1.3 论文的立题依据、目的、研究内容和方案  15-17
    1.3.1 立题依据  15-16
    1.3.2 研究目的  16
    1.3.3 研究内容  16-17
第二章小麦白粉菌 Real-time PCR检测技术  17-32
  2.1 材料及设备  17-19
    2.1.1 试验材料  17
    2.1.2 主要试验仪器及试剂  17-19
  2.2 试验方法  19-24
    2.2.1 供试菌株的收集与保存  19-20
    2.2.2 供试材料DNA提取及DNA浓度的测定  20-22
    2.2.3 小麦白粉菌Real-time PCR引物设计  22
    2.2.4 引物特异性及灵敏性的检测  22-23
    2.2.5 引物Real-time PCR检测  23
    2.2.6 标准曲线的制作  23-24
  2.3 结果与分析  24-31
    2.3.1 供试材料DNA检测  24-25
    2.3.2 引物Bgt-2F/Bgt-2R的特异性检测  25-26
    2.3.3 引物的灵敏性检测  26-28
    2.3.4 Real-time PCR扩增结果  28-29
    2.3.5 引物浓度优化  29-30
    2.3.6 标准曲线  30-31
  2.4 小结  31-32
第三章小麦Real-time PCR检测技术  32-44
  3.1 材料及设备  32
    3.1.1 试验材料  32
    3.1.2 主要试验仪器及试剂  32
  3.2 试验方法  32-36
    3.2.1 供试材料DNA提取及DNA浓度的测定  32
    3.2.2 小麦Real-time PCR引物的设计  32-34
    3.2.3 小麦引物特异性和灵敏性的检测  34-35
    3.2.4 小麦引物Real-time PCR扩增  35
    3.2.5 标准曲线的制作  35-36
  3.3 结果与分析  36-42
    3.3.1 供试材料DNA检测  36
    3.3.2 引物特异性检测  36-39
    3.3.3 引物灵敏性检测  39-41
    3.3.4 Real-time PCR扩增结果  41-42
    3.3.5 标准曲线  42
  3.4 小结  42-44
第四章人工接种叶片小麦白粉菌的Real-time PCR测定  44-50
  4.1 材料和设备  44
    4.1.1 试验材料  44
    4.1.2 主要试验仪器及试剂  44
  4.2 试验方法  44-46
    4.2.1 人工接种方法  44-45
    4.2.2 取样及发病情况调查  45
    4.2.3 小麦叶片基因组DNA的提取  45
    4.2.4 植物DNA对病原菌Real-time PCR扩增的影响  45
    4.2.5 人工接种的小麦叶片中的白粉菌Real-time PCR检测  45-46
  4.3 结果与分析  46-49
    4.3.1 植物DNA对病原菌Real-time PCR扩增的影响检测  46
    4.3.2 人工接种叶片发病情况调查及Real-time PCR检测  46-49
  4.4 小结  49-50
第五章田间小麦叶片潜育侵染的Real-time PCR测定  50-61
  5.1 材料与方法  50-51
    5.1.1 试验材料  50-51
    5.1.2 主要试验仪器及试剂  51
    5.1.3 数据分析  51
  5.2 结果与分析  51-60
  5.3 小结  60-61
第六章结论与讨论  61-64
  6.1 结论  61-62
  6.2 讨论  62-64
    6.2.1 应用SYBR Green Ⅰ荧光染料法进行Real-time PCR扩增  62
    6.2.2 Real-time PCR扩增对起始模板的准确定量  62
    6.2.3 潜伏侵染小麦白粉菌Real-time PCR检测结果与最终病情指数的关系  62-63
    6.2.4 试验中需注意的问题  63-64
参考文献  64-69
附录  69-72
致谢  72-73
作者简历  73

小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Real-time PCR检测技术的研究

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