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荔枝果皮褐变过程中POD活性变化及其基因表达分析

作　者: 张永丽
导　师: 金志强
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 植物分子遗传学
关键词: 荔枝果皮褐变过氧化物酶多酚氧化酶花色素苷类黄酮总酚基因表达
分类号: S667.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 515次
引　用: 2次
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内容摘要

我国是世界上最大的荔枝生产国,占世界荔枝种植总面积的90%和总产量的80%。但是,荔枝成熟于夏季高温季节,采后果皮易脱水褐变,变干易碎流汁,且容易滋生病菌,降低了其商品价值,严重限制了荔枝市场的开拓。加强荔枝采后生物学研究可为荔枝采后技术开发提供基础与依据。前人多从采后生理学角度对荔枝果皮褐变机理进行研究,但还未见关于荔枝采后分子生物学的研究报道。本研究从生理水平和分子水平阐释荔枝果皮褐变机制,希望探明荔枝果皮褐变过程中差异表达的基因并研究其表达规律。以妃子笑荔枝为试材,研究了采后荔枝果皮褐变过程中的一些生理变化。以室温无包装条件下荔枝果皮衰老过程中每隔8h的生理与外观变化,结果发现:采后妃子笑荔枝常温贮藏48h后果皮褐变指数有个明显升高的趋势,72h内果皮完全褐变。果皮褐变过程中果皮失水量持续增加。以室温包装保湿条件下荔枝果皮衰老过程中每隔24h的生理与外观变化,结果发现:72h内荔枝果皮褐变情况不明显。测定了室温25℃±1℃,空气湿度70%±5%条件下每隔8h和室温包装保湿条件下每隔24h荔枝果皮褐变过程中荔枝果皮的PPO、POD、花色素苷、类黄酮和总酚含量,结果发现:果皮多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的活性在采后贮藏过程中都有不同程度的升高,荔枝果皮花色素苷、类黄酮和总酚都呈下降趋势。同时,在相同的贮藏时间等条件下,常温贮藏的荔枝果实褐变指数、果皮的多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性均比保湿贮藏的高;而荔枝果实的好果率、果皮的花色素苷、类黄酮和总酚均比保湿贮藏的低,这表明常温贮藏荔枝的贮藏性较保湿贮藏荔枝的贮藏性差。实验室构建了采收0h时果皮的cDNA文库,建立了采后果皮褐变相关的抑制差减杂交文库,获得了荔枝果皮的四条POD基因,对获得的POD基因进行生物信息学分析,过氧化物酶基因(POD1)长度为1363 bp,经Genscan分析后发现,该序列含有一个完整的阅读框,编码区长1062bp,编码353个氨基酸。过氧化物酶基因(POD2)长度为1376 bp,经Genscan分析后发现,该序列含有一个完整的阅读框,编码区长990 bp,编码329个氨基酸。而另两个过氧化物酶基因POD3、POD4经Genscan分析,都不含有完整的阅读框。表达分析结果:POD1基因8h时在样品中上调表达,而16h、24h、32h、40h、48h时POD1基因在两样品中无差异表达;POD2基因在8h、16h时在两样品中无差异表达,而24h、32h、40h、48h时候下调表达;POD3基因全时段在两样品中皆无差异表达;POD4基因8h时上调表达,而16h、24h、32h、40h、48h时在两样品中无差异表达。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 前言  10-25
  1.1 植物过氧化物酶研究进展  11-24
    1.1.1 过氧化物酶分子结构特点  11-15
    1.1.2 过氧化物酶的反应机理  15-16
    1.1.3 过氧化物酶的分离纯化  16-17
    1.1.4 过氧化物酶的生理功能  17-22
      1.1.4.1 参与木质素和木栓质的合成  17-18
      1.1.4.2 参与活性氧代谢过程  18-19
      1.1.4.3 参与生长素的降解  19-20
      1.1.4.4 参与植物对外界不良胁迫的应答  20-21
      1.1.4.5 参与植物组织褐变  21-22
    1.1.5 POD 与PPO 的关系  22-23
    1.1.6 酶蛋白基因表达与调控的分子生物学  23-24
  1.2 本研究目的意义  24-25
2 实验材料、试剂及仪器  25-27
  2.1 实验材料  25-26
  2.2 试剂与试剂盒  26
  2.3 实验仪器  26-27
3 实验方法  27-34
  3.1 微阵列方法获得POD 基因  27
  3.2 RT-PCR 方法分析目的基因的表达情况  27-31
    3.2.1 荔枝果皮总RNA 的提取  27-28
    3.2.2 cDNA 第一链的合成  28-29
    3.2.3 RT-PCR 引物设计  29-30
    3.2.4 RT-PCR 反应体系  30-31
      3.2.4.1 POD1 的 RT-PCR 体系及程序  30
      3.2.4.2 POD2 的 RT-PCR 体系及程序  30
      3.2.4.3 POD3 的 RT-PCR 体系及程序  30-31
      3.2.4.4 POD4 的 RT-PCR 体系及程序  31
  3.3 采后不同贮藏时间荔枝果皮POD 基因的表达变化  31
  3.4 果实褐变分级  31-32
  3.5 过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的提取与活性的测定  32-33
  3.6 果皮花色素苷、总酚和类黄酮含量的测定  33-34
4 结果与分析  34-64
  4.1 荔枝果皮POD 酶基因的获得  34-51
    4.1.1 四个POD 核苷酸序列  34-36
    4.1.2 POD1 基因全长序列的生物信息学分析  36-39
      4.1.2.1 Genscan 分析阅读框  36-37
      4.1.2.2 同源性分析  37-39
      4.1.2.3 保守结构域分析  39
    4.1.3 POD2 基因全长序列的生物信息学分析  39-43
      4.1.3.1 Genscan 分析阅读框  39-41
      4.1.3.2 同源性分析  41-42
      4.1.3.3 保守结构域分析  42-43
    4.1.4 POD3 基因序列的生物信息学分析  43-46
      4.1.4.1 Genscan 分析阅读框  43-44
      4.1.4.2 同源性分析  44-46
      4.1.4.3 保守结构域分析  46
    4.1.5 POD4 基因序列的生物信息学分析  46-49
      4.1.5.1 Genscan 分析阅读框  46-47
      4.1.5.2 同源性分析  47-49
      4.1.5.3 保守结构域分析  49
    4.1.6 四个基因与其他物种的聚类分析  49-51
  4.2 RT-PCR 方法分析目的基因的表达情况  51-53
    4.2.1 RNA 的提取  51
    4.2.2 采后不同时间荔枝果皮POD 基因的RT-PCR 表达分析  51-53
  4.3 采后不同贮藏时间荔枝果皮POD 基因的表达变化  53-54
  4.4 荔枝果皮采后几个生理指标的变化  54-58
  4.5 荔枝果皮中几种酶活性的测定  58-64
    4.5.1 荔枝果皮中多酚氧化酶和过氧化物酶的活性测定  58-60
    4.5.2 荔枝果皮中花色素苷、类黄酮、总酚含量的测定  60-64
5 讨论  64-67
  5.1 关于生物信息学预测基因功能  64
  5.2 关于荔枝果皮RNA 提取  64-65
  5.3 关于荔枝果实采后贮藏过程中几个生理指标的变化  65-66
  5.4 关于荔枝果皮褐变过程中差异表达的基因  66
  5. 5 半定量 PCR 法在研究相关基因表达方面的应用  66-67
6 结论  67-69
参考文献  69-77
缩写词英汉对照  77-78
致谢  78

荔枝果皮褐变过程中POD活性变化及其基因表达分析

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