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采后荔枝果皮衰老过程中生理变化与基因差异表达分析

作　者: 王家保
导　师: 金志强
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 荔枝果皮衰老含水量抑制差减杂交 cDNA文库 cDNA微阵列基因表达
分类号: S667.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

荔枝是一种亚热带至热带果树,在华南农业经济中占有重要地位。然而,采后衰老过程中果皮发生的一些变化如褐变及病菌侵染等严重降低了荔枝的商品价值,缩短了荔枝的货架期。深入研究荔枝采后生物学问题可为开发荔枝保鲜技术提供基础与依据。虽然已有学者对若干果皮衰老相关的若干问题进行了大量研究,但目前对采后荔枝果皮衰老的机制依然不甚明了,有关采后荔枝果皮衰老分子生物学的研究报道更少。为了探讨采后荔枝果皮的衰老机制,为进一步荔枝采后生物学研究提供基础,本研究以妃子笑荔枝果实为试材,研究了室温无包装条件下每隔8h的果皮生理变化。通过cDNA微阵列杂交筛选,获得了一批在采后不同阶段果皮及不同荔枝组织中差异表达的基因,进一步研究了这些基因的表达规律。主要结果如下:妃子笑荔枝果实在实验条件下72h内完全褐变。在褐变过程中,荔枝果实与果皮的失水量持续上升,果实失水主要由果皮失水引起。采后48h内,果皮主要散失自由水,在48h以后,束缚水下降较快。果皮的总酚含量在采后0-72h内持续下降,类黄酮、花色素苷含量在采后40h后下降。衰老过程中,果皮pH值缓慢上升。果皮相对电导率持续升高,至采后40h时达到最高;丙二醛含量则缓慢升高,至采后64h时达到最高。多酚氧化酶活性在32h后快速下降至一稳定水平。过氧化物酶活性在32h内上升,此后亦下降至一稳定水平。LOX活性在32h时有一高峰,此后剧烈下降至一稳定水平。果皮抗坏血酸含量在24h内保持稳定,此后持续下降。谷胱甘肽含量在采后24h内保持稳定,32h时升至最高,高峰保持16h后下降。抗坏血酸过氧化物酶活性总体上呈下降趋势,而谷光甘肽还原酶活性则呈单峰曲线,峰值维持在采后24h-32h。通过对获得的各项数据进行相关分析、逐步回归分析及通径分析后发现:果皮含水量与果皮失水量是影响果皮褐变的主要因素。聚类分析表明,以32h-40h之间为界,妃子笑荔枝果皮的衰老过程可分为2个阶段。前期,即阶段Ⅰ的果皮褐变指数变化较慢,主要散失自由水,可能主要发生非酶促褐变;阶段Ⅱ的果皮自由水与束缚水均散失,褐变指数在48h以后剧烈上升,可能主要发生酶促褐变。在生理变化研究基础上,我们进一步研究了果皮衰老过程中的基因差异表达。首先建立了快速从果皮中提取总RNA的方法,然后构建了采后0h果皮的cDNA文库,并分别以0h果皮总RNA和32h果皮总RNA为TESTER,构建了正向和反向抑制差减杂交(SSH)文库。之后,从cDNA文库中随机挑取了11636克隆,从正向SSH文库和反向SSH文库中各挑取了284个克隆及78个克隆, PCR扩增了这些克隆的插入片段,以回收的PCR产物作探针,制做了含12000探针的cDNA微阵列。以采后0h果皮样品为共同对照,设计了11组杂交组合,用以筛选在采后不同时间果皮中及荔枝不同组织中发生差异表达的基因。通过杂交分析,分别从采收0h果皮cDNA文库、正向SSH文库及反向SSH文库中选择了2444个、49个、17个差异表达克隆。对这些克隆进行测序,各获得了2136、45、17条有效EST序列,分别拼接成为836、20、16个基因簇(Clusters)。在来自0hcDNA文库的836个clusters中,含287个重叠群,549条单一序列。依据序列分析结果进一步测序获得了200余条含完整开放读码框的cDNA序列。Blastx结果表明,共403个Clusters获得了基因功能注释,这些基因中有221个在Gene Ontology数据库中进行了功能分类,KEGG注释将150余条基因填入了不同的代谢途径。共获得采后0-48h内差异表达基因709个,其中,从0h果皮cDNA文库中得到693个,正向SSH文库中得到20个,反向SSH文库中得到16个。经BLASTx比对有功能注释的基因405条,未知功能基因131条,无匹配基因172条。聚类分析表明,这些基因的表达规律可分为4种类型。随机选取若干基因进行RT-PCR检测基因表达的结果与cDNA微阵列杂交结果基本一致。众多基因发生了差异表达说明果皮的衰老是一个多基因调控的复杂过程。功能已知的差异表达基因中有大量基础代谢相关基因、次生代谢相关基因、细胞壁代谢相关基因、转录因子、胁迫响应蛋白、激素应答元件、细胞信号传导、细胞防御相关基因等。由于参与淀粉、蔗糖、脂肪酸、磷脂、甘油脂、蛋白质等分解代谢的基因多数上调表达,而参与其合成代谢的相关基因多呈下调表达,因此在果皮衰老过程中果皮的分解代谢受到促进,合成代谢受到抑制。另外,依据基因的表达规律推测,果皮衰老过程中类黄酮类色素合成降低,木质素合成则可能上升,且细胞壁的降解加快。通过综合分析各类基因表达规律后发现,编码某些热击蛋白、WRKY类转录因子、锌指蛋白类转录因子等的基因和淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢、半乳糖代谢、类黄酮合成、叶绿体能量代谢等代谢途径可能在调节采后果皮衰老中具有重要的作用。依据cDNA微阵列杂交结果,我们还获得了分别在果肉、果皮、种子、叶片、花和根中特异表达的基因39、22、20、11、6和8个,其中,有功能注释的基因分别为27、18、16、6、5和5个。RT-PCR检测结果与cDNA微阵列检测结果基本一致。这些基因的获得为进一步克隆组织特异型启动子提供了基础。总之,本研究发现了影响果皮衰老的主要因素和果皮衰老的进程,获得了一批在果皮衰老过程中差异表达的基因及组织特异性表达基因,发现有大量差异表达基因参与了多种代谢途径,说明荔枝果皮衰老是一个多因素影响的复杂过程,其中一些基因的表达变化可能在调节荔枝果皮衰老过程中起重要作用。这些结果为进一步的荔枝采后生物学研究提供了基础与依据。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-13
1 前言  13-52
  1.1 荔枝产业概述  13-14
  1.2 荔枝采后生物学概述  14-38
    1.2.1 荔枝果实概述  14-15
    1.2.2 荔枝果实的呼吸作用与乙烯释放规律  15-16
    1.2.3 采后荔枝果皮褐变机理  16-27
    1.2.4 采后荔枝果肉品质的变化  27-28
    1.2.5 荔枝采后保鲜贮运技术  28-37
    1.2.6 荔枝采后生物学研究的问题与展望  37-38
  1.3 荔枝采后分子生物学研究进展  38-44
    1.3.1 组织培养再生体系的研究进展  38-41
    1.3.2 荔枝重要功能基因的克隆与表达分析  41-42
    1.3.3 荔枝遗传转化研究进展  42-43
    1.3.4 研究展望  43-44
  1.4 抑制差减杂交技术及其在植物研究中的应用  44-48
    1.4.1 抑制差减杂交技术的原理  44-46
    1.4.2 抑制差减杂交技术的应用  46-48
  1.5 cDNA 微阵列技术及其在植物研究中的应用  48-50
    1.5.1 cDNA 微阵列技术的原理及其特点  48
    1.5.2 cDNA 微阵列技术的应用  48-50
  1.6 本研究的目的、意义及技术路线  50-52
2 采后荔枝果皮衰老过程中一些生理变化的研究  52-68
  2.1 材料与方法  52-56
    2.1.1 材料  52
    2.1.2 测定指标及方法  52-56
  2.2 结果与分析  56-65
    2.2.1 果皮褐变指数与好果率的变化  56
    2.2.2 果皮水分含量变化  56-57
    2.2.3 果皮色素及总酚含量变化  57-58
    2.2.4 果皮pH 值的变化  58
    2.2.5 果皮丙二醛含量和相对电导率的变化  58
    2.2.6 果皮PPO 与POD 活性的变化  58-59
    2.2.7 果皮LOX 活性的变化  59
    2.2.8 果皮Vc 与GSH 含量的变化  59
    2.2.9 果皮APX、CAT、GR 及SOD 活性的变化  59-60
    2.2.10 果皮褐变相关指标的相关分析  60-64
    2.2.11 褐变相关因素的逐步回归分析与通径分析  64
    2.2.12 果皮衰老阶段的聚类分析  64-65
  2.3 讨论  65-67
  2.4 本章小结  67-68
3 成熟荔枝果实的果皮总RNA 的提取及cDNA 文库的构建  68-81
  3.1 材料与方法  68-75
    3.1.1 材料  68
    3.1.2 主要试剂  68
    3.1.3 实验方法  68-75
  3.2 结果与分析  75-78
    3.2.1 RNA 提取  75-77
    3.2.2 双链cDNA 合成的最佳循环数的确定及ds-cDNA 的分部回收  77
    3.2.3 cDNA 文库的滴度  77-78
    3.2.4 cDNA 文库的插入片段大小  78
  3.3 讨论  78-80
  3.4 本章小结  80-81
4 cDNA 微阵列技术检测采后荔枝果皮衰老过程中差异表达基因及荔枝组织特异性表达基因  81-130
  4.1 材料与方法  81-91
    4.1.1 材料  81
    4.1.2 方法  81-91
  4.2 结果分析与讨论  91-128
    4.2.1 cDNA 微阵列杂交信号及数据质量分析  91-93
    4.2.2 芯片杂交分析结果  93
    4.2.3 差异表达基因的EST 序列分析  93-95
    4.2.4 荔枝果皮采后衰老过程中差异表达基因分析  95-127
    4.2.5 用cDNA 微阵列筛选组织特异性表达基因  127-128
  4.3 本章小结  128-130
5 用抑制差减杂交技术克隆采后荔枝果皮衰老相关基因  130-145
  5.1 材料与方法  130-137
    5.1.1 材料  130
    5.1.2 主要试剂  130
    5.1.3 方法  130-137
  5.2 结果与分析  137-143
    5.2.1 RNA 的质量  137-138
    5.2.2 LD-PCR 循环数的确定  138
    5.2.3 抑制差减杂交的PCR 扩增结果  138-139
    5.2.4 抑制差减文库的构建及其插入片段的大小  139
    5.2.5 序列处理与拼接  139
    5.2.6 用cDNA 微阵列筛选抑制差减杂交文库中的差异表达基因  139-140
    5.2.7 抑制差减杂交文库中差异表达的基因及其表达  140-142
    5.2.8 抑制差减杂交文库筛选结果与cDNA 文库筛选结果比较  142-143
  5.3 讨论  143
  5.4 本章小结  143-145
6 总的讨论  145-147
  6.1 关于采后荔枝果皮衰老的进程  145-146
  6.2 关于荔枝影响荔枝果皮衰老的重要基因和代谢途径的探讨  146
  6.3 下一步的研究计划  146-147
7 结论  147-148
参考文献  148-161
附录Ⅰ 引物及比对结果  161-202
  附表1 RT-PCR 检测一些基因表达时的引物序列  161-162
  附表2 在采后荔枝果皮衰老过程中差异表达的已知功能基因的Blastx 结果及其表达  162-192
  附表3 RT-PCR 检测一些SSH 文库基因表达时的引物序列  192-193
  附表4 采后0h 与32h 荔枝果皮的抑制差减杂交文库测序获得的基因  193-202
附录Ⅱ 一些基因片段的cDNA 序列  202-205
附录Ⅲ 在读博士期间承担的与本研究有关的课题与发表的论文  205-206
致谢  206

采后荔枝果皮衰老过程中生理变化与基因差异表达分析

内容摘要

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