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酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的敲除

作　者: 郭晓贤
导　师: 黄建忠
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 基因敲除同源重组酿酒酵母乙醇脱氢酶II
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

酵母发酵生物质产生的生物乙醇是一种可再生的液体燃料，最有希望替代最终将被耗尽的化石能源，同时这也支持可持续发展。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被广泛应用于生物乙醇的发酵生产。在酿酒酵母中有五个基因ADH1-ADH5编码与乙醇代谢相关联的乙醇脱氢酶，其中的四种乙醇脱氢酶Adh1p，Adh3p，Adh4p和Adh5p在葡萄糖发酵过程中将乙醛还原为乙醇，而Adh2p则催化相反的反应将乙醇氧化为乙醛。当外界环境中的葡萄糖被耗尽后Adh2p负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应。为构建一株乙醇高产的酿酒酵母，我们尝试通过基因敲除手段敲除ADH2来阻断Adh2p催化的乙醇代谢支路通道来提高乙醇的产量。分别从SGD和GenBank获得ADH2和pUG6质粒的序列，设计一对嵌合引物以及六条验证引物。其中上下游嵌合引物的5’末端分别由45个与ADH2上下游同源的核苷酸组成；3’端则分别由19和22个与pUG6质粒上的loxP-kanMX-loxP序列组件两端同源的核苷酸组成。验证引物A，D分别位于ADH2的上下游；B，C位于ADH2上；KB，KC则位于kanMX上。由嵌合引物通过扩增pUG6质粒中的loxP-kanMX-loxP序列组件产生ADH2基因敲除序列组件。将ADH2基因敲除序列组件转化至酵母细胞后，分别与ADH2序列上下游同源的45 bp序列将引发两次同源重组事件，最终以loxP-kanMX-loxP取代基因组中的ADH2并赋予转化子G418抗性。经菌落PCR验证为阳性转化子后进一步转化携带可赋予抗生素Zeoin抗性的bler标记基因质粒pSH65并在含半乳糖的培养基中诱导pSH65表达Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组实现标记挽救。移除质粒pSH65后通过重复同样的步骤敲除另外一个ADH2等位基因后获得了一株ADH2基因敲除的纯合子菌株。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-11
第1章绪论  11-25
  1.1 课题背景  11-14
    1.1.1 国内外燃料乙醇的发展状况  11-14
    1.1.2 发酵产乙醇微生物的选育  14
  1.2 酿酒酵母的基因功能研究  14-20
    1.2.1 基因敲除技术  15-20
      1.2.1.1 基因敲除序列组件的构建  16-19
      1.2.1.2 多基因敲除与标记挽救  19-20
  1.3 ADH2基因敲除原理  20-22
  1.4 基因敲除的验证方法  22-25
第2章材料与方法  25-37
  2.1 实验材料  25-29
    2.1.1 菌株与质粒  25
    2.1.2 培养基和培养条件  25-26
      2.1.2.1 菌种保藏斜面培养基  25-26
      2.1.2.2 培养条件  26
    2.1.3 试剂与溶液的配制  26-28
    2.1.4 寡聚核苷酸引物  28
    2.1.5 工具酶  28
    2.1.6 其它试剂  28-29
    2.1.7 常用仪器  29
  2.2 实验方法  29-37
    2.2.1 冷冻干燥菌种的恢复培养  29
      2.2.1.1 安瓿管开封  29
      2.2.1.2 菌株恢复培养  29
    2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备  29-30
    2.2.3 质粒pUG6和pSH65的转化  30
    2.2.4 碱裂解法制备pUG6和pSH65质粒DNA  30-31
    2.2.5 聚合酶链式反应(PCR)  31-32
    2.2.6 乙醇沉淀DNA  32
    2.2.7 菌落PCR验证酵母菌落  32-33
    2.2.8 平板影印法  33
    2.2.9 LiAc/SS载体DNA/PEG高效酵母转化法  33-37
第3章结果与分析  37-73
  3.1 ADH2等位基因缺失的酿酒酵母杂合子的构建  37-55
    3.1.1 验证引物的设计  37-40
    3.1.2 菌落PCR验证出引物的正确性  40-41
    3.1.3 质粒pUG6的制备  41-42
    3.1.4 质粒pUG6的限制性内切酶酶切  42-43
    3.1.5 ADH2基因敲除序列组件的构建  43-49
      3.1.5.1 嵌合引物的设计  43-48
      3.1.5.2 ADH2基因敲除序列组件的构建  48-49
    3.1.6 转化ADH2基因敲除序列组件及筛选转化子  49-50
    3.1.7 引物设计  50-51
    3.1.8 菌落PCR验证ADH2等位基因敲除菌株  51-55
  3.2 ADH2基因敲除酿酒酵母菌株的构建  55-73
    3.2.1 质粒pSH65的制备  56-57
    3.2.2 质粒pSH65的限制性内切酶酶切  57-63
    3.2.3 质粒pSH65的转化  63-64
    3.2.4 kanMX标记基因的诱导切除  64-67
    3.2.5 菌落PCR验证标记挽救后的ADH2杂合子  67-68
    3.2.6 质粒pSH65的移除  68-69
    3.2.7 ADH2基因敲除双倍体菌株的获得  69-72
    3.2.8 出发菌株与ADH2基因敲除菌株形态比较  72-73
第4章讨论  73-75
结论  75-77
附录  77-79
参考文献  79-83
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  83-85
致谢  85-87
个人简历  87-88

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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