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水稻新型硝酸盐转运蛋白基因OsTNrt2.1的克隆、表达和遗传转化

作　者: 徐海荣
导　师: 肖凯
学　校: 河北农业大学
专　业: 作物栽培与耕作学
关键词: 水稻(Oryza sativa) NRT基因 OsTNrt2.1 基因特征基因表达编码蛋白特征表达载体构建遗传转化
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

硝酸盐（NO₃^-）是作物可直接利用的主要氮源之一，硝酸盐供应量的不足经常成为限制作物生长的因素。同时，由于硝酸盐在土壤中易被淋洗，硝态氮肥料的施用导致地下水富营养化现象日益加剧，由此对人类的健康产生了极为不利的影响。提高作物对于硝态氮肥料的利用效率，对于促进资源的高效利用和减轻环境污染具有重要的意义。本项研究根据水稻Nipponbare的OsNrt2.1 cDNA序列，从氮效率较高的水稻品种TP309中克隆了与OsNrt2.1高度同源的硝酸盐转运蛋白（NRT）基因OsTNrt2.1，对于该新型基因的结构和编码蛋白特征、时空表达特性进行了较全面的研究。构建了OsTNrt2.1和该基因启动子片段的植物双元表达载体，通过用上述表达载体遗传转化烟草，初步获得了OsTNrt2.1和该基因启动子的转基因烟草植株，为通过转基因技术鉴定OsTNrt2.1的转运NO₃^-能力和揭示该基因的精细表达特征鉴定了基础。本项研究的主要结果如下：1、通过检索NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站的水稻全基因组数据库，找出推定的高亲和硝酸盐转运蛋白（High-affinity nitrate transporter）OsNrt2.1基因序列（登陆号AB008519）。用该基因的cDNA序列在NCBI进行BLAST分析，检索到了对应的DNA克隆（AP004752），发现该基因没有内含子。依据AP004752的5’和3’侧翼区序列，设计正反向引物，以TP309 DNA为模板，PCR扩增出长度约为1.7 Kb的cDNA片段。将该扩增产物与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a后的阳性克隆测序结果表明，插入片段长度为1707 bp。2、测序结果发现，该基因与来自Nipponbare的OsNrt2.1存在2个碱基的差异，用DNAStar软件将PCR扩增产物序列与OsNrt2.1比对分析表明，该基因与OsNrt2.1高度同源（99.6％），命名为OsTNrt2.1。OsTNrt2.1的cDNA全长1928 bp，其中开放阅读框（ORF）为1602 bp，5’与3’端的非编码区分别为96 bp和230 bp。3、用DNAstar软件对OsTNrt2.1编码蛋白分析表明，OsTNrt2.1含有533个氨基酸残基，分子量为57.2 KDa，等电点8.12。蛋白亲水性分析表明，该蛋白含有12个跨膜域，以及一个由24个氨基酸组成的中心环和一个长的C末端。在第五个跨膜域中，含有一个NNP特征基元A-G-W／L-G-N-M-G。此外，还含有6个保守的蛋白激酶C的识别位点S／T-X-R／K。4、在不同氮源及不同介质氮浓度条件下，OsTNrt2.1的表达表现为器官特异性，在根中的表达高于叶片。表明OsTNrt2.1在根系对于生长介质中NO₃^-的吸收中可能具有重要作用。5、OsTNrt2.1的表达受到NH₄⁺的抑制和NO₃^-的诱导，并表现为典型的昼夜节律特征。在不同NO₃^-浓度下，OsTNrt2.1的表达水平相近，表明OsTNrt2.1是具有双亲和特征的NRT基因。6、采用常规分子克隆技术，构建了将OsTNrt2.1编码阅读框（ORF）正确插入至表达载体pCAMBIA1305相应位点的植物双元表达载体pCAMBIA1305-OsTNrt2.1。用该双元表达载体转化农杆菌LBA4404，采用叶圆片法转化烟草。在含有20 mg/L潮霉素的MS固体培养基上光照培养。筛选出具有选择抗性的遗传转化植株。7、用水稻TP309 DNA为模板，根据OsTNrt2.1侧翼启动子区序列设计正反向引物，扩增了长度不同的OsTNrt2.1启动子片段。采用分子克隆技术，构建了将长度不同的OsTNrt2.1启动子片段正确插入至表达载体pCAMBIA1305相应位点的植物双元表达载体pCAMBIA1305-OsTNrt2.1。用该双元表达载体转化农杆菌LBA4404获得的阳性克隆，转化烟草后获得了转基因植株。为采用启动子缺失分析技术鉴定调控该基因对氦胁迫响应的调控元件奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章引言  11-21
  1.1 NO_3~-吸收的动力学特性  11-12
  1.2 植物NO_3~-转运蛋白的结构和功能  12-14
    1.2.1 高亲和NO_3~-转运蛋白(NRT2)的结构和功能  12-13
    1.2.2 低亲和NO_3~-转运蛋白基因(NRT1)的结构和功能  13-14
  1.3 植物NO_3~-转运蛋白基因的表达调控  14-16
    1.3.1 NO_3~-的诱导调节  14-15
    1.3.2 反馈抑制调节  15
    1.3.3 昼夜节律和碳调节  15
    1.3.4 空间和发育调节  15-16
    1.3.5 NO_3~-转运蛋白自身的调节  16
    1.3.6 其它因素的调节  16
  1.4 启动子在基因表达中的作用  16-19
    1.4.1 启动子的概念及其研究意义  16-17
    1.4.2 高等植物启动子的结构特征及重要调控元件  17-18
    1.4.3 植物启动子的类型以及在基因工程中的研究和应用  18-19
  1.5 根癌农杆菌转化植物细胞的分子机理  19-20
    1.5.1 根癌农杆菌的一般特性  19-20
    1.5.2 Ti质粒的致瘤原理  20
  1.6 研究的目的、意义  20-21
第二章水稻新型硝酸盐转运蛋白基因OsTNrt2.1的克隆  21-31
  2.1 材料和方法  21-26
    2.1.1 材料  21-23
    2.1.2 方法  23-26
  2.2 结果与分析  26-30
    2.2.1 OsTNrt2.1的PCR扩增及阳性克隆的鉴定  26-27
    2.2.2 测序结果及和基因序列和结构特征分析  27-28
    2.2.3 水稻硝酸盐转运蛋白序列分析  28-30
  2.3 讨论  30-31
第三章水稻新型硝酸盐转运蛋白基因OsTNrt2.1的表达  31-38
  3.1 材料和方法  31-33
    3.1.1 材料  31
    3.1.2 方法  31-33
  3.2 结果与分析  33-36
    3.2.1 水稻根系与叶片RNA提取  33-34
    3.2.2 OsTNrt2.1在幼苗中根、叶中的表达特征  34
    3.2.3 NH_4~+对OsTNrt2.1表达的反馈抑制调节  34-35
    3.2.4 昼夜节律对OsTNrt2.1表达的影响  35
    3.2.5 NO_3~-对OsTNrt2.1表达的诱导调节  35-36
  3.3 讨论  36-38
    3.3.1 实验中所用植物RNA提取方法的改进及注意事项  36
    3.3.2 OsTNrt2.1的表达受到MS_4~+的抑制  36-37
    3.3.3 OsTNrt2.1的表达表现为昼夜节律特征  37
    3.3.4 OsTNrt2.1的表达受到NO_3~-的诱导  37
    3.3.5 OsTNrt2.1的表达表现为双亲和特征  37-38
第四章 OsTNrt2.1的双元表达载体构建和遗传转化  38-46
  4.1 材料与方法  38-41
    4.1.1 材料  38-39
    4.1.2 方法  39-41
  4.2 结果与分析  41-44
    4.2.1 表达载体的构建流程  41-42
    4.2.2 重组载体的鉴定  42-44
  4.3 讨论  44-46
第五章 OsTNrt2.1启动子的双元表达载体构建和遗传转化  46-53
  5.1 材料与方法  46-48
    5.1.1 材料  46
    5.1.2 方法  46-48
  5.2 结果与分析  48-51
    5.2.1 OsTNrt2.1启动子及各缺失片段的PCR扩增  48
    5.2.2 启动子区重要调控元件的鉴定和分析  48-49
    5.2.3 融合OsTNrt2.1启动子及不同启动子缺失片段表达载体的构建  49-50
    5.2.4 烟草的遗传转化  50-51
  5.3 讨论  51-53
第六章结论  53-60
在读期间发表的学术论文  60-61
作者简介  61-62
致谢  62-63
附发表文章  63-72

水稻新型硝酸盐转运蛋白基因OsTNrt2.1的克隆、表达和遗传转化

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