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灭活原生质体融合选育α-ALDC-高产菌株

作　者: 周海霞
导　师: 阚振荣
学　校: 河北大学
专　业: 微生物学
关键词: 枯草芽抱杆菌 Q一乙酞乳酸脱梭酶灭活原生质体融合
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 168次
引　用: 5次
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内容摘要

α-乙酰乳酸脱羧酶可以去除啤酒中的双乙酰，在啤酒工业中有着广泛的应用前景。双亲灭活原生质体融合技术优点较多，是原生质体融合育种中针对无遗传标记同种不同株双亲的一种常用的有效方式。因此，对本实验室保存的两株产α-乙酰乳酸脱羧酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行双亲灭活原生质体融合，筛选高酶活菌株。试验首先确定了比较适合的双亲菌株培养条件。选择使用了完全培养液和发酵培养液两种培养基以及完全液体培养基20mL和40mL装液量。绘制了不同条件下的生长曲线，确定了最佳培养条件是：将菌株由斜面接种到完全固体培养基上，活化培养一天，再将其接种到液体完全培养基，37℃，200rpm，摇床培养14h，最后按5％的接种量接种到20mL的液体完全培养基，继续活化3.5—4h。将培养好的菌体收集起来，进行溶菌酶处理，制备原生质体。本试验选择了多个溶菌酶浓度，在32℃条件下处理双亲菌株。通过绘制形成率和再生率曲线，认为在32℃，用50μg／mL的溶菌酶处理双亲菌株20min，形成率较高，而且又有一定的再生能力，适合融合。将制备的V-20原生质体进行紫外灭活，3226—5原生质体进行热灭活，通过分析灭活后原生质体的融合率确定最佳融合条件是用pH9.0的40％的PEG6000，38℃，作用于混合菌液15min。本试验共得到了900株融合子，将这些融合子传代10次并测酶活。最后筛得3株菌，其酶解后的上清液酶活高于亲株。试验最后通过对融合子与双亲菌株的DNA含量的简单比较，进一步验证了筛得的菌株为融合子。

全文目录

第1章引言  9-19
  1.1 研究背景  9-11
    1.1.1 啤酒风味与双乙酰  9-10
    1.1.2 α-乙酰乳酸脱羧酶  10
    1.1.3 除去双乙酰途径  10-11
  1.2 国内外对α-乙酰乳酸脱羧酶的研究现状  11-13
    1.2.1 产α-乙酰乳酸脱羧酶微生物的分离和筛选及酶学性质的研究  11-12
    1.2.2 α-乙酰乳酸脱羧酶的分子生物学研究  12-13
    1.2.3 α-乙酰乳酸脱羧酶的应用  13
  1.3 研究的目的意义  13-14
  1.4 原生质体融合的研究  14-19
    1.4.1 原生质体融合的发展  14
    1.4.2 原生质体融合的优点  14-15
    1.4.3 融合子的检出方式  15-16
    1.4.4 影响原生质体形成和再生的因素  16-17
    1.4.5 影响融合的因素  17
    1.4.6 原生质体融合技术的应用  17-19
第2章原生质体融合  19-33
  2.1 引言  19
  2.2 材料与方法  19-22
    2.2.1 菌种来源  19
    2.2.2 培养基与相关溶液  19-20
    2.2.3 原生质体的制备  20-21
    2.2.4 原生质体灭活  21-22
    2.2.5 原生质体融合  22
  2.3 结果与讨论  22-33
    2.3.1 不同条件下的生长曲线  22-24
    2.3.2 原生质体的形成和再生条件  24-27
    2.3.3 原生质体的灭活条件  27-28
    2.3.4 原生质体的融合条件  28-30
    2.3.5 综合实验  30-31
    2.3.6 讨论  31-32
    2.3.7 结论  32-33
第3章融合子的传代和筛选  33-44
  3.1 引言  33
  3.2 材料  33
    3.2.1 主要试剂及产地  33
    3.2.2 主要仪器  33
  3.3 方法  33-35
    3.3.1 试剂配制  33-34
    3.3.2 发酵培养  34
    3.3.3 制备标准曲线  34-35
    3.3.4 α-乙酰乳酸脱羧酶的活力测定  35
  3.4 结果和讨论  35-44
    3.4.1 菌株筛选结果  35-42
    3.4.2 讨论  42-44
第4章融合子的初步鉴定  44-48
  4.1 引言  44
  4.2 枯草芽孢杆菌DNA含量的测定  44-46
    4.2.1 基因组DNA的提取  44-45
    4.2.2 二苯胺显色测DNA  45-46
  4.3 结果与讨论  46-48
    4.3.1 菌体干重和DNA测定结果  46
    4.3.2 讨论  46-48
第5章结论  48-49
参考文献  49-55
致谢  55

灭活原生质体融合选育α-ALDC-高产菌株

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