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犬瘟热病毒南京株（NJ-15）H基因的克隆、表达以及刺激犬B淋巴细胞分泌IgM的最佳CpG基序的体外筛选

作　者: 莫小见
导　师: 郭爱珍；陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬瘟热病毒 H基因克隆与表达 CpG ODN IgM ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

CpG DNA作为一种新型的免疫佐剂是目前分子免疫学研究的热点之一。CpG DNA是含有CpG基序（CpG motifs）的细菌DNA、质粒DNA和寡核苷酸（ODN）的统称。CpG DNA具有很强的非特异性免疫刺激作用，可在无T细胞存在的情况下直接激活B细胞，亦可直接激活单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞等免疫细胞。早期研究指出，来自多种哺乳动物的细胞可被CpG DNA激活，但是对不同免疫对象而言，具有最佳免疫刺激作用的CpG基序是不同的。因此，筛选各种动物各自的最佳CpG基序对于新型疫苗佐剂的研究开发具有极大理论价值和实用意义。国外已经有关于人和小鼠的最佳基序的研究报道，国内关于CpG的基础性研究尚少，且未见有关犬的最佳CpG基序的研究报道。犬瘟热（Canine distemper，CD）是对犬等食肉目动物危害最大的病毒性传染病之一，而犬瘟热病毒（Canine distemper virus，COY）NJ-15株则是南京地方分离株。为了探讨CDV NJ-15株的致病机理，研制免疫保护率高、保护期长的犬瘟热基因工程疫苗，本研究对与CDV NJ-15株致病性和免疫原性密切相关的血凝素蛋白（H）基因进行了克隆、序列分析，分别构建了原核表达载体和真核表达载体，并对表达产物的免疫原性进行了初步研究。另外，本研究进行了刺激犬B淋巴细胞分泌IgM的最佳CpG基序的体外筛选试验，为CDV基因工程疫苗的研制提供有的放矢的新型佐剂材料。 1 犬瘟热病毒NJ-15株H基因的T-A克隆与序列分析将CDV NJ-15株感染Vero细胞收获病毒，参照RNAgents^R Total RNA Isolation System（Promega公司）的说明，提取CDV NJ-15株基因组RNA为模板，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR），扩增到包含H基因全长约1.9Kb的基因片段。将RT-PCR产物T-A克隆到pMD 18-T载体中，经蓝白斑和酶切分析筛选到阳性克隆载体命名为pMD-H。并对CDV NJ-15株H基因的序列进行分析。 2 犬瘟热病毒NJ-15株H基因片段的克隆和表达对克隆载体pMD-H进行双酶切，将得到的1058bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-28b（+）中。将重组质粒转化进宿主菌Rosctta^TM中，在37℃ 1mM IPTG诱导下该片段获得良好的表达。经SDS-PAGE鉴定其表达的融合蛋白质约38KDa，与预期值一致。免疫转印试验显示，体外表达的该重组蛋白可被CDV参考株Onderstepoort兔抗血清识别，表明该重组蛋白具备天然H蛋白的部分抗原表位。pET28-H虽然未表达了H蛋白的全基因，然而免疫转印证实其仍然具有某些天然蛋白的关键性表位，为研制CDV的亚单位疫苗提供了候选材料。犬应热病.南京株（N十1 5）H签因的克隆、裹达以及弱傲犬B淋巴细胞分泌l脚的.佳饰口共序的体外娜选3犬应热病毒NJ一15H基因片段的克隆和及其在真核细胞中的瞬时衰达对克隆载体pM}H进行双醉切，将得到的cDV血凝素蛋白（H）基因插入含有以V启动子的pcDNA3.1/Zeo质粒载体中，通过脂质体介导转染COS一细胞，用SDS一PAGE和免疚转印分别鉴定表达产物的相对分子量及其免疚特性.结果证明获得正向插入的PcONA一H重组表达质粒，表达产物的相对分子1约77kDa，与预期值大小一致，且该表达产物能够被CDv参考株Dnder:tepo。rt的兔血清识别，表明构建的pcnN^一H重组质粒能在哺乳动物细胞中表达并且具有抗原性，该重组质粒有可能用作CDv的DN人疫苗.4刺激犬B淋巴细胞分泌l脚的最佳饰G ODN的体外筛选制备犬B淋巴细胞，进行体外培养，以人工合成的24种CpG ODN分别刺激之，48h后收集培养上清，ELISA检测IgM.发现第12号cpG ODN（5’ggGGcT旦工旦旦工工TcTG“993’）具有最佳的免疫刺激性，与国外学者断近报道的结果相符，为cDv的。NA疫苗提供了可供选择的位剂.

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
第一篇文献综述  11-40
  第1章犬瘟热病毒分子生物学研究进展  11-30
    1 基因组RNA  11-13
    2 病毒结构蛋白  13-18
    3 病毒非结构蛋白  18
    4 CDV免疫应答反应  18-19
    5 CDV感染与免疫抑制  19-20
    6 CDV的持续性感染  20-21
    7 CDV分子生物学诊断技术  21
    8 CDV基因工程疫苗  21-30
  第2章 CpG DNA的免疫激活机制及其在基因工程疫苗上的应用研究  30-40
    1 CpG DNA的概念  30
    2 CpG的种属特异性  30-31
    3 CpG基序的免疫激活机制  31-32
    4 CpG DNA对亚单位疫苗的免疫增强作用  32-33
    5 CpG DNA对DNA疫苗的免疫增强作用  33-34
    6 CpG基序优化DNA疫苗的设计  34-40
第二篇试验研究  40-90
  第3章犬瘟热病毒南京株(NJ15)H基因基因的克隆和序列分析  40-56
    1 材料  41
    2 方法  41-45
    3 结果  45-52
    4 讨论  52-56
  第4章犬瘟热病毒南京株(NJ15)H基因片段的原核表达与鉴定  56-69
    1 材料  56-57
    2 方法  57-62
    3 结果  62-63
    4 讨论  63-69
  第5章犬瘟热病毒南京株(NJ15)H基因基因的克隆及其在真核细胞中的瞬时表达  69-80
    1 材料  69-70
    2 方法  70-73
    3 结果  73-74
    4 讨论  74-80
  第6章刺激犬B淋巴细胞分泌IgM的最佳CpG ODN的体外筛选  80-90
    1 材料  80-83
    2 方法  83-85
    3 结果  85-87
    4 讨论  87-90
全文总结  90-91
致谢  91

犬瘟热病毒南京株（NJ-15）H基因的克隆、表达以及刺激犬B淋巴细胞分泌IgM的最佳CpG基序的体外筛选

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