学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

β淀粉样多肽人源性抗体的筛选与鉴定

作　者: 夏骏
导　师: 陈琪；范乐明
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理生理学
关键词: 噬菌体抗体库 Aβ1-42 人单克隆杭体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 57次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种严重危害人类健康的神经退行性疾患，是老年性痴呆最常见的形式之一。65岁以上的老年人口发病率约为5％～10％，患病风险随年龄的增长而急剧上升。目前临床上尚未找到行之有效的治疗方法。大量证据表明，β淀粉样多肽(β amyloid peptide,Aβ)在AD患者脑内的大量产生、聚集以及沉积而形成老年斑(senile plaque,SP)，是阿尔茨海默病的发病基础，它在AD的发生、发展过程中起了关键性作用。Aβ一般由40～42个氨基酸组成，系β淀粉样前体蛋白(APP)的酶解产物，其中Aβ1-42更易聚集，形成淀粉样沉着，而且其神经毒性更大，因此Aβ也被人们公认为治疗AD的靶标。围绕Aβ展开对AD的治疗特别是免疫治疗，因其特异性高，副作用小，因此更加受到重视。在AD的动物模型中，不论是被动免疫还是主动免疫，都取得了比较好的疗效，不仅能够明显减轻Aβ负荷，使脑内的淀粉样蛋白斑块得到清除，而且能够减少行为学损伤。本研究选择Aβ1-42作为靶标，应用噬菌体抗体库技术，制备Aβ的全人源性抗体，并鉴定其特异性及活性。方法：用戊二醛法将抗原Aβ1-42包被到Nunc免疫管上，应用噬菌体抗体库技术，筛选特异性的抗体。收集每轮从Nunc免疫管上洗脱的噬菌体并进行扩增，再用于下一轮筛选。同样的“吸附-洗脱-扩增”的富集反应共进行了4轮。筛选出的抗体的活性用ELISA法来进行鉴定，用辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(HRP-anti-M13)来检测噬菌体抗体。提取部分阳性克隆的噬菌粒(phagemid)并转染大肠杆菌HB2151。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达产生可溶性的单链抗南京医科大学硕士学位论文体片段(SeFv)，用于蛋白印记检测(Western blot)。依次与抗c一myc抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG反应，最后用二甲基联苯胺(diaminobenizidine，DAB)进行显色。结果:经过四轮筛选，随机挑选了192个克隆进行ELI SA检测，共获得了56个阳性克隆。挑选了其中8个阳性率较高的单克隆，用以转染大肠杆菌HBZ 1 51，再用IPTG进行诱导表达，生成含有可溶性的SeFv抗体的上清。经Western blot鉴定，其中Nl克隆诱导表达的可溶性ScFv能够特异性的与A日1一42结合，而与牛血清白蛋白(BSA)没有交叉反应。结论:该技术便捷有效，可不经免疫制备出高特异性的人源性抗体，为开展阿尔茨海默病的诊断以及免疫疗法莫定了基础。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
第一章前言  11-15
第二章材料与方法  15-29
  一、实验材料  15-18
    (一) 、人噬菌体半合成ScFv抗体库  15
    (二) 、主要材料与试剂  15-16
    (三) 、培养基与培养板  16-17
    (四) 、主要溶液  17-18
    (五) 、主要仪器  18
  二、实验方法  18-29
    (一) 、人噬菌体抗体库的扩增  18-21
    (二) 、制备次级噬菌体抗体库  21
    (三) 、筛选Aβ1-42特异性人源性抗体  21-23
    (四) 、 ELISA鉴定单克隆噬菌体抗体  23-25
    (五) 、 Western blot鉴定可溶性ScFv抗体  25-29
第三章结果  29-43
  一、人噬菌体抗体库的扩增情况  29-30
  二、筛选Aβ1-42特异性人源性抗体结果  30-33
  三、 ELISA鉴定单克隆噬菌体抗体  33-41
  四、 Western blot鉴定可溶性ScFv抗体  41-43
第四章讨论  43-47
  一、噬菌体抗体库及其载体  43-44
  二、应用噬菌体抗体库制备全人源性抗体  44-45
  三、单克隆人源性抗体的鉴定及其应用  45-47
第五章小结  47-48
参考文献  48-55
致谢  55-56
综述  56-66

β淀粉样多肽人源性抗体的筛选与鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文