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鱼源Fab噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗SAs抗体的可溶性表达

作　者: 闫晓敏
导　师: 邹世平
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: Fab噬菌体抗体库筛选基因表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

抗体因其独特的重组类型和基因结构形成巨大的多样性,不仅可以通过结合抗原来有效保护机体,同时也是生物技术、临床诊疗、药物检验检测等许多科学研究中的重要工具。噬菌体抗体库技术因其能够高效快速的制备高亲和力的特异性抗体,被誉为功能抗体研究史上的巨大变革。目前,该技术已在医学、基础理论研究、药物制造生产、残留检测以及病害防治等方面发挥了重要的作用。但是,在发展相对滞后的水产领域,该技术的应用研究还少有报道。基于斑点叉尾鮰抗体基因信息已比较清晰,所以,本试验对本室自建的斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库(赵琳,2009)进行筛选、鉴定并对筛得抗体进行可溶性表达。具体工作如下：1抗体库筛选：以偶联卵血清蛋白的磺胺甲氧嗪(Sulfamethoxypyridazine,SMP)和磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazde,SMZ)为固相包被抗原,将包被板处理后,对自建的斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库进行筛选,经过5轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选过程,获得特异性较强的Fab抗体,并对抗体进行鉴定。主要结果如下：1)从Fab噬菌体抗体库中经过5轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选,分别得到抗SMP阳性克隆株9个,抗SMZ阳性克隆株10个。经ELISA检测,结果证明所筛得抗体具有一定特异性。2)分别经SacI+Xba、SpeI+XhoI双酶切鉴定后,证实所得到的片段大小与预想目的片段大小一致。2 Fab段的可溶性表达：挑选噬菌体抗体阳性克隆感染大肠杆菌XL1-Blue,扩增提取质粒DNA,经双酶切构建Fab可溶性表达载体p3MHSA,转化大肠杆菌XL1-Blue,经IPTG诱导,收集培养液及菌体裂解液上清。进行ELISA、SDS-PAGE和Western blot检测。结果如下：1)ELISA结果显示在菌体裂解液上清及培养液中均可检测到可溶性抗体Fab段的表达,与理论上是一致的。且该抗体分别与偶联蛋白的磺胺甲氧嗪和磺胺甲恶唑可特异性结合。2)SDS-PAGE及Western-blot结果证明,抗SMZ克隆分别有4个克隆、抗SMP克隆有3个克隆在48KD处出现明显条带,与理论计算值相符,说明表达成功。3)通过对表达较好的阳性克隆的可变区进行GenBank检索DNA序列分析,证实该克隆轻链可变区、重链可变区氨基酸序列与GenBank中斑点叉尾鮰免疫球蛋白轻链、重链同源性均在80%-90%。通常同一基因家族的同源性在85%以内,因此可以断定我们所获得的轻链和重链基因均来自斑点叉尾鮰且VH属于斑点叉尾鮰免疫球蛋白VH3基因家族,轻链V区属于斑点叉尾鮰免疫球蛋白VK1基因家族。本研究从自建的斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库中成功筛选得到抗两种磺胺类药物的抗体,并证实了此抗体的有效性,希望噬菌体抗体库及相关技术可以成为一种有效的制备鱼源单抗的方法,在水产动物的基础研究及实际应用上发挥作用。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
英文缩略词表  10-11
1 文献综述  11-17
  1.1 噬菌体抗体库技术  11-12
  1.2 噬菌体抗体库表达载体系统  12
  1.3 抗体库分类  12-13
  1.4 噬菌体抗体库技术的特点  13-14
  1.5 噬菌体抗体库的筛选  14-15
  1.6 噬菌体抗体库技术的应用  15-16
  1.7 噬菌体抗体库技术在水产养殖上的应用价值  16-17
2 研究的目的与意义  17-18
3 材料与方法  18-27
  3.1 实验材料  18-20
    3.1.1 菌株  18-19
    3.1.2 工具酶、Marker及试剂盒  19
    3.1.3 主要试剂和培养基  19-20
    3.1.4 主要仪器  20
  3.2 试验方法  20-27
    3.2.1 辅助噬菌体敏感宿主菌的制备  20
    3.2.2 辅助噬菌体的扩增  20-21
    3.2.3 辅助噬菌体滴度测定  21
    3.2.4 抗体库的扩增  21
    3.2.5 包被板的制备  21
    3.2.6 噬菌体抗体库的筛选  21-22
    3.2.7 单克隆噬菌体抗体的制备  22
    3.2.8 噬菌体单抗的ELISA鉴定  22
    3.2.9 ELISA阳性的噬菌粒的酶切鉴定  22-23
    3.2.10 Fab段的可溶性表达载体构建  23-24
    3.2.11 感受态大肠杆菌的制备  24
    3.2.12 可溶性表达载体转化大肠杆菌  24-25
    3.2.13 可溶性表达载体在大肠杆菌内表达  25
    3.2.14 可溶性Fab ELISA鉴定  25
    3.2.15 SDS-PAGE电泳  25-26
    3.2.16 Western-blot分析  26-27
    3.2.17 DNA测序  27
4 结果与分析  27-36
  4.1 辅助噬菌滴度测定  27-28
  4.2 抗体库滴度测定  28
  4.3 抗体库的筛选  28-29
  4.4 单克隆抗体的ELISA鉴定  29-30
  4.5 酶切鉴定片段插入  30-31
  4.6 可溶性表达载体构建  31-32
  4.7 可溶性Fab ELISA鉴定  32-33
  4.8 可溶性Fab SDS-PAGE鉴定  33
  4.9 Western-blot分析  33-35
  4.10 抗体重链和轻链可变区DNA序列的测序分析  35-36
5 讨论  36-42
  5.1 辅助噬菌体的扩增与定量  36-38
  5.2 噬菌体抗体库的筛选  38-39
  5.3 噬菌体Fab抗体在大肠杆菌内的表达  39-42
6 小结  42-43
参考文献  43-50
附表一  50-51
附表二  51-52
附表三  52-53
附表四  53-54
致谢  54

鱼源Fab噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗SAs抗体的可溶性表达

内容摘要

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