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河豚毒素的中毒、检测及评价

作　者: 达情
导　师: 沈敏
学　校: 苏州大学
专　业: 法医学
关键词: 河豚毒素法医毒理学 LC-MS/MS检测分布
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

河豚鱼肉质鲜美,营养丰富,自古以来亚洲的一些国家如中国、日本等便有食用河豚的习俗。由于河豚鱼含有剧毒物质河豚毒素(tetrodotoxin,简称TTX),因此食用河豚中毒的事件屡有发生。据报道日本每年食用河豚中毒死亡人数占同期食物中毒死亡人数的70%以上。我国幅员辽阔,有着大量的河豚资源,因此在沿海地区食用河豚中毒的情况相当严重。由于TTX的相关基础性研究相对滞后,检测技术难以满足体内痕量TTX的检测要求,使得涉及TTX中毒的法医学鉴定、临床诊断救治以及食品安全的监控难以进行。本文旨在构建“高效、灵敏、准确”的分析策略,建立基于固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测生物检材中的河豚毒素的方法,并将其应用到实际生物样品的分析中,为河豚毒素中毒的法医学鉴定、临床诊治以及食品安全的监控提供技术保障。本论文分为五个部分。第一章综述了TTX的研究现状。对TTX的特点、应用、检测技术等进行了介绍。着重讨论了TTX目前常用的的检测技术。立足检测方法的建立、完善、优化并以之为出发点,提出了本论文的研究内容。第二章建立了血液、尿液以及肝中TTX的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(SPE-LC-MS/MS)的检测方法,并进行了全面系统的方法学验证。血液、尿液和肝中TTX检出限分别为2ng·mL(g)-1、2ng·mL(g)-1和4ng·mL(g)-1,定量下限均在5 ng·mL(g)-1以下,在5~100 ng·mL(g)-1范围内线性关系良好,相关系数r≥0.9973;日内精密度和日间精密度均在12.80%以内;回收率大于47.2%。该方法为河豚毒素中毒的法医学鉴定、临床诊治以及食品安全的监控提供了新的借鉴。第三章建立了河豚毒素中毒动物实验模型,通过动物实验,观察中毒症状以及变化,运用LC-MS/MS的检测方法,定性定量检测河豚毒素中毒的体内分布的情况。结果表明在高剂量组中肺和血液中可以检测到较高含量的TTX,在中剂量组中,尿液和肺中可以检材到较高含量的TTX,而在低剂量组中,尿液可以检测到TTX。这为法医学检案中河豚毒素中毒案件的评价提供了借鉴。同时,在此基础之上,利用高分辨质谱(LTQ-Orbitrap)技术,对可能存在的TTX代谢物进行了探索寻找。第四章建立了鱼片干中河豚毒素的检测方法,通过动物实验研究,说明该品牌的鱼片干中所含TTX的含量足以对人体造成伤害。另一方面,基于本研究中对鱼片干进行烘烤的处理方法,对脱水河豚毒素进行了检测和表征。第五章总结了本论文的成果与创新点,并提出进一步的研究方向。本论文的研究中,所建立的检测生物检材中的TTX的方法可以适用于全血、尿液、肝等检材,也适用于鲜河豚鱼以及经过烘烤加工过的河豚鱼干等样品。所建方法的灵敏度、准确度等均可以满足食品安全监测、临床救治以及法医学检验和司法鉴定实践中的各种需要。目前,该方法已运用于实际检案。在进行动物实验研究中的过程中,首次采用了灌胃的方式,对TTX在动物体内的分布做了全面的定性定量检测,对比了各器官体液中的分布情况,为各类涉及到TTX中毒引起的案件的取材提供了借鉴依据。另一方面,在该动物实验的同时,借助LTQ-Orbitrap等高精端一流仪器对于TTX在动物体内的代谢、吸收、消除等过程进行了探索研究。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-23
  1.1 河豚鱼中毒的概述  11-14
    1.1.1 TTX 的理化性质  11-12
    1.1.2 TTX 的毒理作用  12
    1.1.3 TTX 的体内分布与代谢动力学毒理作用  12-14
  1.2 TTX 中毒的检测  14-19
    1.2.1 TTX 的提取  14
    1.2.2 TTX 的检测  14-19
  1.3 其他  19-20
  1.4 本论文的立题依据与研究内容  20-23
    1.4.1 选题依据  20
    1.4.2 选题目的  20-21
    1.4.3 选题意义  21-23
第二章固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测生物检材中的河豚毒素  23-31
  2.1 引言  23
  2.2 实验部分  23-28
    2.2.1 试剂与仪器  23-24
    2.2.2 样品前处理  24
    2.2.3 仪器条件  24-26
    2.2.4 方法学验证  26-28
  2.3 讨论  28-30
    2.3.1 样品处理方法的优化  28-29
    2.3.2 色谱柱的选择  29
    2.3.3 梯度洗脱的选择  29-30
  2.4 案例应用  30
  2.5 结论  30-31
第三章河豚毒素中毒豚鼠体内分布研究  31-42
  3.1 材料与试剂  31
  3.2 仪器及条件  31
  3.3 样品前处理  31
  3.4 工作曲线  31
  3.5 染毒与取材  31
  3.6 结果  31-33
    3.6.1 中毒症状  31-32
    3.6.2 体内分布  32-33
  3.7 讨论  33-35
    3.7.1 组织的采集和保存  33
    3.7.2 河豚毒素中毒豚鼠的体内分布  33-34
    3.7.3 实验剂量选择  34-35
    3.7.4 胃肠组织分布讨论  35
    3.7.5 其他  35
  3.8 代谢过程的探索  35-42
    3.8.1 高分辨质谱（LTQ-Orbitrap）技术的简介  35-36
    3.8.2 TTX 代谢物的探索  36-42
第四章鱼片干中河豚毒素的检测和动物实验研究  42-52
  4.1 鱼片干提取法  42
  4.2 实验部分见第二章  42
  4.3 讨论  42-48
  4.4 案例应用  48-51
    4.4.1 检测与结果  48-51
    4.4.2 动物实验  51
  4.5 鱼片干定量结果  51
  4.6 结论  51-52
第五章结束语  52-54
  5.1 创新点  52-53
  5.2 进一步研究方向  53-54
参考文献  54-57
作者部分相关论文题录  57-58
致谢  58-59

河豚毒素的中毒、检测及评价

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