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共振光散射新技术在生化药物分析中的应用研究

作　者: 庞小兵
导　师: 黄承志
学　校: 西南师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 共振光散射技术全内反射共振光散射技术水/四氯化碳水/1 2-二氯乙烷流动注射分析-共振光散射联用技术共振光散射比率法粒度分析核酸小檗碱肝素
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

1993年Pasternack等人首次提出共振光散射(resonance light scattering，RLS)技术，用于生物大分子组装化学以来。共振光散射技术因其实验仪器简单，方法灵敏度高而倍受广大化学研究者关注。在近10年来发展迅速，已成为超分子化学、物理化学和分析化学领域中强有力的分析技术。但随着RLS技术的进一步发展，其弊端也日益明显。表现在：(1)选择性差，RLS技术基于本体溶液测定，无法消除溶液中共存物质的光散射信号的干扰，限制了RLS技术选择性的进一步提高；(2)在一些体系中，RLS信号不稳定，重现性差，限制了不稳定分析试剂在RLS技术的应用；(3)RLS技术作为常规分析技术还没有应用于在线检测。(4)基于单波长测定的RLS技术，受仪器条件，电源电压的外界因素影响较大。为了弥补RLS技术的不足，我们将RLS技术与液／液界面(liquid／liquid interface)上的全内反射(total internal reflection)现象相结合，建立了全内反射共振光散射(total internal reflected resonance light scattering，TIR-RLS)技术，通过分析试剂与被分析物形成具有两亲性的复合物(amphiphilic species)并集在水／油界面(water／oil interface)，将被分析物与水溶液中的共存物干扰成分。使得TIR-RLS技术具有更好的选择性和更高的灵敏度。同时，我们将流动注射分析技术(flow injection analysis，FIA)方法的高度重复性，高效率，易于实现自动化的特点结合RLS技术的灵敏度高，仪器简单的特点，成功开发了流动注射—共振光散射(flow injection analysis-resonance light scattering，FIA-RLS)联用技术，使RLS技术克服了信号不稳定的缺点。此外，为克服单波长测定受仪器、电源等外界因素的影响，而发展了RLS比率分析法，并将此方法成功应用于卟啉在肝素上聚集研究，该方法较RLS技术能够更灵敏地表征化学反应的动力学过程。主要研究西南师范大学硕士论文论文摘要内容如下: 1.以核酸、肝素、小聚碱为研究对象，在液/液界面上运用nR.RLS技术建立灵敏的分析方法，主要结果如下: (l)在pH 3.3，离子强度0.003 molL‘时，澳化十六烷基三甲基按(crMAB)与核酸通过静电引力共吸附到液/液界面上形成双性复合物，导致强烈的TIR·RLS信号，最大峰位于370.0 nm，TIR一RLS信号强度与核酸的浓度呈线性关系，方法检出限小于6.0 ng mL‘。该方法对普通金属离子抗干扰能力比RLs技术的抗干扰能力要高出100倍，方法用于合成品分析，回收率在94.4%一104.8%之间，结果令人满意。 (z)当pH 7.00，离子强度0.oosmulL‘的条件下，核酸与u(llD和苯扎澳馁(Benzalkanium Bromide，BzB)相互作用形成三元双亲性的复合物u(Ilx}核酸一苯扎澳按，该复合物吸附和富集在水/四氯化碳(HZo/Ccl4)界面上，引起迅速增强的TIR一R此信号，其标a、位于365.0 nm，所得信号强度与核酸浓度成比例关系，由此建立测定核酸的灵敏方法，ctDNA，fsDNA和yRNA的检测限分别为7·sng mL，，6.sng mL-‘和4.sng mL-‘，方法具有良好的选择性。 (3)在pH 8.00条件下，荧光素(fluoreseein，Flu)与小聚碱(b etherine，BE)形成双亲性的复合物，在水/1，2，二氯乙烷(场侧DCE)界面富集，并引起强烈增加的TIR一RLS信号，漏ax位于373.0nm，所得信号强度在一定范围内与BE浓度成正比关系，检测限为1.3 ng mL‘。由此建立测定BE的灵敏方法。方法与药典使用的HPLC方法对照，本方法在分析灵敏度有大大提高。 (4)当pH为6.09，离子强度为o.oo6molL-‘的条件下，肝素(heparin)通过与具有双亲性的罗丹明B(thodamineB，RhB)和澳化十六烷基三甲馁(eetyltrimethylammonium bromide crMAB)相互作用形成三元双亲性的复合物RhB一肝素.CTM户卫，而被RhB和CTM泊丑协同吸附在水/四氯化碳(HZO/CC功界面上，引起迅速增强的TIR一R璐信号，其标ax位于365.0 nm，所得信号强度与肝素浓度成比例关系，由此建立测定肝素的灵敏方法，检测限是3.1 ng mL‘该方法具有良好的选择性。 2.建立了FIA.RLS联用技术并用于肝素含最测定，主要结果如下: (l)在pH2.2条件下，meso一四一(对三甲氨基苯基)叶琳似2卫JP)为探针“‘了西南师范大学硕士论文论文摘要测定了肝素，标ax位于457.0nm。在本实验中用LED代替Xe灯作为激发光源，标ax为459.Onln。固定激发和发射波长在459.0 nm，进行时间扫描，RLS强度与肝素浓度成正比，测定线性范围。一12.00林9 mL‘，检出限4.8 ng mL‘，分析结果证明FL气.RLS技术分析灵敏，操作简单且自动化，试剂消耗量小。方法用于测定肝素注射液实际样品所得结果与厂家标示一致。 (2) pH7.%，离子强度为0.009 molL，，吩噬嗦类碱性染料天青B与痕量的肝素共存时，由于肝素磺酸基和梭酸基的存在而结合成复合物，导致R璐强度显著增强，几max位于340.Onm。坛和人m在340.0 nm，进行时间扫描所得谱线R璐强度与肝素浓度成正比，从而建立测定肝素的F认一R比方法，线性范围是0.01一6.0雌ml一‘，检出限为9.5 ng ml-l。方法用于测定肝素注射液实际样?

全文目录

论文摘要  4-12
缩写符号对照表#ⅷ  12-13
第一章绪论  13-23
  1.1 光散射理论  13-14
  1.2 共振光散射技术的简介  14-21
  1.3 本文拟达到的目的和意义  21-23
第二章全内反射共振光散射光谱技术在生化药物中的应用  23-50
  2.1 CTMAB-核酸全内反射共振光散射法测定核酸  23-30
  2.2 La(Ⅲ)-核酸-苯扎溴铵全内反射共振光散射法测定核酸  30-37
  2.3 荧光素-小檗碱全内反射共振光散射测定小檗碱  37-43
  2.4 罗丹明B-肝素-溴化十六烷基三甲基铵测定肝素  43-49
  2.5 本章小节  49-50
第三章流动注射-共振光散射联用技术测定肝素  50-64
  3.1 FIA技术发展概况简述  50-51
  3.2 H_2TAPP-肝素流动注射-共振光散射联用技术测定肝素  51-58
  3.3 天青B-肝素流动注射-共振光散射联用技术测定肝素  58-63
  3.4 本章小节  63-64
第四章 RLS比率法研究两种阳离子卟啉在肝素分子的聚集及其分析应用  64-78
  4.1 RLS技术研究两种阳离子卟啉在肝素分子的聚集及分析应用  64-68
  4.2 RLS比率法研究两种阳离子卟啉在肝素分子的聚集及分析应用  68-77
  4.3 本章小节  77-78
第五章全文总结及展望  78-79
第六章参考文献  79-86
附录1 硕士研究生期间发表论文  86-87
附录2 致谢  87

共振光散射新技术在生化药物分析中的应用研究

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