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中国实验小型猪肝细胞的低温保存与复苏培养的初步研究

作　者: 刘鸿凌
导　师: 王英杰
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 生物人工肝肝细胞小型猪细胞培养低温保存冷冻保存聚乙二醇 UW液二甲基亚砜三明治胶原凝胶
分类号: R575
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

近年来，生物人工肝支持系统和肝细胞移植研究的迅速开展，使有关肝细胞材料的研究日益增多。由于人肝细胞来源的匮乏以及肝细胞株的潜在不安全性，猪肝细胞已逐渐成为目前生物人工肝研究的主要细胞材料。随着生物人工肝和相关学科研究的深入，迫切需要有效的肝细胞保存方法以适应基础和临床研究的需要。低温保存（hypothermic preservation）是目前保持肝细胞生物学活性的重要方法，可分为两大类：一类为4℃左右短期保存；另一类为-80℃以下的超低温长期保存，亦即冻存（cryopreservation）。对冻存而言，国内外多采用分阶段降温、快速复温的方法，但对冻存保护剂（cryoprotective agent，CPA）的浓度、冻存液的组成、细胞浓度及保存时间等报道不一。针对以上情况，本实验在4℃、-80℃和-196℃三种温度下对影响猪肝细胞低温保存的多种因素进行了探讨，包括低温保存时细胞的合适浓度、保存时间的持久性、最佳DMSO浓度、低温保存液的合理配制以及肝细胞复苏后的培养等。实验方法与结果如下：一、猪肝细胞的4℃低温保存采用两步灌流法分离新生乳猪肝细胞，将肝细胞分别移入普通RPMI-1640培养液、含有5％聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的RPMI-1640培养液以及UW液中，于4℃保存24～72 h，复苏后接种培养肝细胞，检测其存活率、贴壁率及代谢与合成功能，并观察形态结构变化等。结果显示不同低温保存液、不同保存时间后复苏肝细胞的活力、生物学功能及形态学表现等均有所不同；其中普通RPMI-1640培养液保存组肝细胞的存活率和贴壁率最低，而含PEG的RPMI-1640培养液或UW器官保存液均能较好的保持乳猪肝细胞活力达48 h；PEG组肝细胞保存72 h后仍能维持60%左右的存活率。光镜观察：低温保存24～48 h 后，UW液组和PEG组肝细胞复苏后的的形态和结构与新分离培养的肝细胞类似，细胞生长旺盛，胞膜完整，胞浆内颗粒丰富，可见较多双核细胞，核仁清楚。电镜观察：低温保存后的猪肝细胞粗面内质网有所减少，光面内质网相对增多，但仍然可见到较多的溶酶体和线粒体。上述结果表明猪肝细胞在4℃下可保存48 h；RPMI-1640培养液中加入PEG，或<WP=9>使用UW保存液均可较好地保持肝细胞活性。二、猪肝细胞-80℃低温冻存-80℃保存可将肝细胞直接放入超低温冰箱，步骤简单，操作方便，且可大量冻存。为探讨-80℃低温保存所需的合适CPA及其浓度，以及保存时间对乳猪肝细胞活力的影响，本研究以含5%～20% DMSO的低温保存液在-80℃下分别保存肝细胞30或60 d，复苏后接种培养，检测细胞存活率、贴壁率、白蛋白表达水平及尿素合成能力，观察其形态和结构的变化。结果表明不同DMSO浓度的低温保存液组猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同；其中5% DMSO低温保存液组效果最差，10% DMSO组次之，15% DMSO组最佳。15% DMSO低温保存液组保存60 d肝细胞复苏后的存活率约81%，贴壁率约79%，显著优于5%与10% DMSO组（P < 0.05），且复苏后培养肝细胞的形态类似未冻存组，仍保持较强的尿素代谢及白蛋白合成能力。可见，15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的-80℃低温保存，保存时间至少达2个月。三、猪肝细胞-196℃超低温冻存-196℃条件下，细胞几乎停止所有的新陈代谢活动。因此，可将肝细胞放入液氮中进行长期保存，这是目前公认的储存肝细胞的理想方法。为探讨合适的猪肝细胞液氮长期冻存的条件，本课题分别采用不同DMSO浓度和细胞浓度对乳猪肝细胞进行-196℃冷冻保存，结果显示在不同浓度DMSO冷冻保存液条件下，猪肝细胞的生物学活性及形态特征均有差别；其中5% DMSO冷冻保存液组保存效果最差，15%组最佳。15% DMSO组保存2个月肝细胞的平均存活率达83%，贴壁率达81%，接种培养后细胞形态与未冻存组相似，仍能保持较强的尿素合成能力，RT-PCR检测表明有较高的白蛋白mRNA水平。乳猪肝细胞在以浓度为（5～10）×106个细胞/ml冻存时，复苏细胞的存活率明显优于（1～2.5）×106个细胞/ml组。可见，冻存时细胞的浓度对冻存后肝细胞的存活率亦存在明显影响。为进一步分析肝细胞复苏后培养的条件与方法，本研究对液氮冻存4个月后的乳猪肝细胞进行不同的胶原凝胶培养，即混合凝胶（胶原和肝细胞混合并形成凝胶状后）培养或三明治（胶原－肝细胞－胶原）培养。结果显示，混合凝胶培养的肝细胞可在凝胶中立体生长，而三明治培养方式可见肝细胞呈集落状成条束样生长。两种凝胶培养方法下肝细胞的形态均很快转变为多边形，多数细胞内可见双核，核仁清楚，细胞之间边界明亮清晰；48 h后肝细胞的多边形特征更加典型，1 W后仍能保持较好的多边形特征。提示胶原凝胶培养方式能为肝细胞提供较好的基质支持和生长条件，从而在较长时间内维持肝细胞的生物学活性。<WP=10>综上所述，本研究探讨了影响乳猪肝细胞低温保存的因素，优化了肝细胞低温保存的条件与方法，为肝细胞的建库提供了实验依据，必将有利于以肝细胞培养为基础的生物人工肝研究的全面展开，有利于肝细胞移植、药物代谢以及毒性试验等相关研究的进行。

全文目录

英文缩写  4-5
英文摘要  5-8
中文摘要  8-11
论文正文中国实验小型猪肝细胞的低温保存与复苏培养的初步研究  11-66
  前言  11-13
  第一部分原代乳猪肝细胞4℃低温保存的初步探讨  13-29
    材料与方法  13-17
    结果  17-21
    讨论  21-29
  第二部分冻存保护剂浓度对乳猪肝细胞-80℃低温保存的影响  29-41
    材料与方法  29-33
    结果  33-36
    讨论  36-41
  第三部分乳猪肝细胞-196℃低温保存及培养的初步研究  41-56
    材料与方法  41-45
    结果  45-49
    讨论  49-56
  全文结论  56-57
  存在问题与展望  57-58
  致谢  58-59
  全文参考文献  59-66
文献综述肝细胞低温保存及应用研究进展  66-73
  参考文献  71-73
攻读硕士学位期间发表的文章  73

中国实验小型猪肝细胞的低温保存与复苏培养的初步研究

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