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appA植酸酶基因与纳豆激酶基因的克隆与表达研究

作　者: 陈寅
导　师: 张志芳
学　校: 中国农业科学院
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: Escherichia coli appA phytase nattokinase thrombus fibrinolysis silkworm baculovirus
分类号: Q785
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

植酸是植物性饲料中磷的主要贮存形式，植酸酶是一种能将植酸水解并释放出无机磷的酶，它广泛存在于微生物与植物中。由于单胃动物如猪、鸡等的消化道中植酸酶活性很低，导致它们无法有效利用植酸磷。同时，植酸也是一种抗营养因子，因为它能螯合许多动物生长所必须的微量元素。大肠杆菌来源的appA植酸酶是一种新型的植酸酶，与常规的黑曲霉植酸酶相比具有许多优点，如与猪、鸡等畜禽胃的pH环境更加适应，与底物植酸更强的亲合性以及对消化道蛋白酶更强的抵抗性。此外它还是目前所知的植酸酶中水解植酸能力最强的酶。本实验从猪粪中筛选出一个高产植酸酶的E.coli菌株，根据Dassa等报道的序列设计一对引物通过PCR方法扩增了appA基因。测序结果显示appA基因阅读框架为1299bp，编码432个氨基酸，编码产物理论分子量为47.06kD，同时它也具有其它植酸酶与酸性磷酸酶的活性保守基序RHGxRxP。为了大量表达appA植酸酶，我们将appA基因分别克隆至原核表达载体pET-28a（+）和杆状病毒转移载体pVL-1393中，将其分别置于lac和polyhedrin启动子控制之下。用乳糖诱导使appA基因在大肠杆菌菌株BL21中得到了高效表达。另外，通过共转染和筛选纯化获得了携带appA基因的重组家蚕杆状病毒。感染五龄家蚕后appA植酸酶的表达量达到平均每毫升血淋巴7710U。通过SDS-PAGE发现大肠杆菌与家蚕的表达产物中分别有一条50kD与53kD的特征条带。两个表达系统中表达的重组appA植酸酶的最适温度与最适pH一致，分别为60℃与pH4.5。Ca²⁺与Mn²⁺都能提高酶的活性。由appA植酸酶在家蚕生物反应器中的超量表达以及appA植酸酶本身所具有的酶学特性推断，家蚕表达的appA植酸酶适合于作为新一代植酸酶添加剂应用于饲料工业与畜禽养殖业中。纳豆激酶是一种能够在体内及体外直接分解交联纤维蛋白的新型溶血栓酶。本实验以B.subtilis（natto）基因组DNA为模板扩增了nk基因，测序结果显示与Nakamura报道的纳豆激酶基因高度同源，其氨基酸序列也含有丝氨酸蛋白酶的活性保守中心（serine 221，histidine 64，aspartic acid 32）。将nk基因克隆至转移载体pVL-1393中后用常规方法获得重组病毒，感染家蚕后纳豆激酶获得正确表达。由于纳豆激酶是一种蛋白酶，我们首先检测并发现表达产物具有蛋白酶活性，通过纤维蛋白平板检测表达产物具有溶圈活性，表明表达的纳豆激酶具有溶解血栓的生物学功能。

全文目录

引言: 植酸酶及其基因工程研究进展  9-18
  1 植酸酶与其应用  9-13
    1.1 植酸酶及其作用  9-10
    1.2 植酸酶来源  10-12
    1.3 植酸酶酶学性质  12-13
  2 植酸酶基因工程研究  13-15
    2.1 在微生物中高效表达植酸酶基因  13-14
    2.2 植酸酶的热稳定性  14-15
    2.3 转基因植物植酸酶基因工程  15
  3 appA植酸酶的研究进展  15-16
  4 植酸酶在食品、医药中的应用  16-17
  5 发展方向及应用前景  17-18
第一章一般材料与常规方法  18-32
  第一节一般材料  18-23
  第二节常规方法  23-27
  第三节细胞和病毒常规操作方法  27-32
第二章大肠杆菌植酸酶基因appA的克隆与原核表达  32-42
  1 材料与方法  33-34
  2 结果  34-39
    2.1 高效菌株筛选  34
    2.2 基因克隆  34-35
    2.3 appA基因的原核表达  35
    2.4 appA植酸酶的酶学特性  35-39
  3 讨论  39-42
第三章利用家蚕生物反应器生产appA植酸酶  42-53
  1 材料与方法  43-44
  2 结果  44-50
    2.1 质粒构建  44
    2.2 重组病毒的筛选与鉴定  44-45
    2.3 SDS-PAGE分析  45
    2.4 appA植酸酶基因在家蚕幼虫中的表达  45
    2.5 BEVS表达的appA植酸酶的酶学特性  45-46
    2.6 appA植酸酶的热稳定性  46-50
  3 讨论  50-53
第四章纳豆激酶基因的克隆及其在家蚕杆状病毒表达载体系统的表达  53-65
  第一节纳豆激酶研究进展  53-57
    1 纳豆激酶及其溶栓作用  53-55
    2 纳豆激酶的分子生物学  55-56
    3 纳豆激酶的基因工程表达  56-57
  第二节纳豆激酶基因在家蚕杆状病毒表达载体系统的表达  57-65
    1 材料与方法  57-60
    2 结果  60-62
      2.1 nk基因的克隆与测序  60-62
      2.2 共转染与重组病毒的制备  62
      2.3 活力的检测  62
    3 讨论  62-65
结论  65-66
参考文献  66-75
致谢  75

appA植酸酶基因与纳豆激酶基因的克隆与表达研究

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