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张氏疤痕止痒软化膏有效组分及其配伍研究

作　者: 吴建国
导　师: 秦路平；张宏
学　校: 第二军医大学
专　业: 生药学
关键词: 张氏瘢痕止痒软化膏增生性瘢痕有效成分复方作用机制药效
分类号: R286.0
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

增生性瘢痕属于病理性瘢痕,是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理现象。其组织学特点是以成纤维细胞增殖异常和胶原为主的细胞外基质过度沉积。增生性瘢痕发病率高,常常破坏人体表面的完整性或伴有各种程度的功能性障碍,给病人带来精神和身体上的双重痛苦,目前其仍是现代医学的一大难题。“张氏疤痕止痒软化膏”由五倍子、威灵仙、泽兰、牡丹皮、川芎五味药材组成,临床上用于治疗灼伤或手术后的增生性瘢痕。从上世纪60年代应用以来,治疗数万瘢痕增生病人,疗效显著,有着深厚的临床基础,但是该复方也存在有效成分不明确、作用机制不清楚,造成药物的安全性、稳定性、可控性较差,以及临床应用不方便、病人依从性较差等缺点。本研究采用组织块培养法分离瘢痕成纤维细胞,按照张氏疤痕止痒软化膏原方以90%的乙醇回流提取五倍子、威灵仙、泽兰、牡丹皮、川芎五味药材(重量比为100:8:20:10:50)。所得到的浸膏用石油醚萃取后,再用大孔树脂D101富集分段,最后得到了石油醚部位、水洗脱部位、30%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位、70%乙醇洗脱部位、90%乙醇洗脱部位。通过MTT法研究对成纤维细胞增殖活性的抑制作用,结果发现石油醚部位、70%乙醇洗脱部位、90%乙醇洗脱部位三个部位的活性较好。采用薄层色谱和HPLC分析,这些部位的成分包括了川芎挥发油、泽兰挥发油、威灵仙挥发油、五倍子挥发油和没食子酸、齐墩果酸、丹皮酚,最后对这些活性成分进行活性筛选确认,再通过均匀设计得到有效成分的最佳比例为川芎挥发油:五倍子挥发油:齐墩果酸:没食子酸为2:2:1:1。本研究以瘢痕成纤维细胞为模型,初步探讨最佳配伍复方的细胞作用机制。首先考察五个不同浓度(0、25、50、100、200μg/mL)的复方对FB作用12,24,48 h后,FB的细胞增殖活力。采用流式细胞术,AV-PI染色检测细胞的凋亡率;以2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)和罗丹明123(Rhodamine 123)为探针,间接检测细胞内ROS活性和?Ψm;并用分光光度法测定Caspase-3的活性。结果发现复方作用12h后,成纤维细胞中ROS活性水平较空白组显著提高(P<0.01),并且随剂量增加而增加。复方作用24 h后,随给药剂量的增加细胞凋亡率显著增加(P<0.05);?Ψm则表现为随剂量增加而降低(P<0.05);Caspase-3水平随剂量增加而增加(P<0.05)。实验得出以下结论,复方能抑制成纤维细胞增殖,并诱导细胞凋亡,通过提高细胞中的ROS活性水平,降低线粒体膜电位?Ψm,增加Caspase-3活性,提示线粒体膜电位去极化在复方诱导细胞凋亡中起重要作用。最后,应用新西兰兔建立兔耳增生性瘢痕模型,从整体动物水平,对瘢痕膏的药效进行了进一步的研究评价。将川芎挥发油、五倍子挥发油、没食子酸、齐墩果酸,按照2:2:1:1的比例加基质配制成含量为5%,10%,20%的高、中、低剂量组的复方瘢痕膏,观察与阳性药物组张氏疤痕止痒软化膏和空白组模型组之间的效果差异。在兔耳瘢痕在造模后第5天,开始给药(1次/天),并用游标卡尺测得瘢痕厚度。用药后14,28 d两个不同时间点,观察瘢痕的外观,并测量瘢痕厚度。最后切取兔耳瘢痕组织,进行HE染色;同时通过ELISA测定组织的胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、基质金属蛋白酶1、转化生长因子β1水平。结果发现该配伍能够显著抑制兔耳瘢痕胶原Ⅰ、Ⅲ的合成和转化生长因子β1表达,同时提高基质金属蛋白酶1活性,表明瘢痕膏对增生性瘢痕具有较好的防治效果。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
缩略词表  9-10
前言  10-13
第一章抑制瘢痕成纤维细胞增殖活性部位的研究  13-28
  第一节瘢痕成纤维细胞的分离与培养  13-20
  第二节基于张氏疤痕止痒软化膏原方有效部位研究  20-28
第二章有效部位的活性成分研究  28-44
  第一节有效部位的主要成分研究  28-34
  第二节药材主要成分的提取制备  34-39
  第三节基于成纤维细胞的活性有效成分研究  39-44
第三章有效成分的最佳配伍及其作用机制研究  44-63
  第一节有效成分的均匀设计实验  44-49
  第二节配伍复方促进成纤维细胞凋亡的机制研究  49-63
第四章复方瘢痕膏对兔耳增生性瘢痕的药效研究  63-74
  第一节兔耳增生性瘢痕模型的建立  63-67
  第二节生化指标分析以及病理切片观察  67-74
第五章研究总结与讨论  74-76
综述病理性瘢痕的治疗研究进展  76-80
参考文献  80-87
致谢  87

张氏疤痕止痒软化膏有效组分及其配伍研究

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