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从抗氧化代谢途径对黄芩品质形成“逆境效应”的研究

作　者: 陈顺钦
导　师: 陈平；黄璐琦
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 黄芩悬浮细胞抗逆基因温度土壤水分基因表达激素
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi为唇形科药用植物黄芩的干燥根,其性寒味苦,具有清热燥湿、止血安胎、解毒等功效。黄芩苷、黄芩素等黄酮类化合物是黄芩的主要有效成分,通过本课题研究,从抗氧化代谢的角度初步揭示了高温、低温和土壤缺水对黄芩体内主要黄酮类物质积累的调控作用及其对药材品质形成的影响,同时也通过悬浮细胞平台初步揭示了外源植物生长调节剂通过对内源激素的影响调控黄芩苷和黄芩素积累的基本规律,研究成果如下:(1)从黄芩叶中首次克隆出两个与植物抗逆相关的基因片段,分别是RNA解旋酶和Clp蛋白酶,通过同源比较,证明它们分别与其他物种的同源基因具有很高的相似性。黄芩是一种比较耐旱的中药材,这为丰富从基因转录水平调控因素观察黄芩耐旱的机理机制奠定了分子生物学基础。(2)实验证明高温(40℃)和低温(8℃)通过不同的途径影响了黄芩中黄酮类成分的积累,形成不同作用机制。40℃高温逆境促进了黄芩有效成分的消耗,显著降低了黄芩素含量,主要是由于后期黄芩体内的CAT、APX酶活降低至对照水平,而黄芩有效成份参与了持续高温下黄芩的活性氧(ROS)清除。POD基因表达表现出组织特异性。低温条件下,由于CHS酶基因的表达受到显著抑制,导致黄芩中黄芩苷、黄芩素和总黄酮含量均显著降低,而抗氧化酶系统和大量游离脯氨酸起到了抗氧化胁迫的重要作用。(3)实验证明适当的土壤缺水有助于黄芩根中黄酮类成分的长期稳定的积累。这是由于12%土壤含水量逆境效应一直存在但又不是很严重,使黄芩素积累保持在较高的水平来抵御土壤缺水造成的胁迫。根中脯氨酸的浓度、RNA解旋酶和Clp蛋白酶基因表达量也在处理过程中显著高于对照,显示了黄芩对此逆境的适应调整。(4)外源激素通过内源激素影响次生代谢物的积累,本实验的研究找到了分别显著提高黄芩苷和黄芩素积累的外源植物生长调节剂组合,即5 mg/L NPA+1 mg/L GA3组合使黄芩苷的含量提高6倍,5mg/L NPA+低中高浓度的PP333,均提高黄芩素含量达15倍以上。实验表明,提高内源IAA含量有助于积累黄芩苷,而提高内源ABA含量有助于黄芩素的积累。本研究成果对于阐明黄酮类成分的生理学和生态学功能以及道地药材黄芩药品的品质形成具有一定的理论意义,为指导高品质黄芩生产提供了理论依据,并有利于黄芩种植业的可持续发展。同时对于今后扩大筛选更优更适的植物生长调节剂组合,为黄芩素、黄芩苷工业化培养生产提供技术支撑,也为合理使用植物生长调节剂生产优质药材提供理论和技术基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第1章绪论  10-23
  1.1 环境因子对中药材次生代谢物积累及道地药材形成的影响  10-14
    1.1.1 道地药材与逆境效应  11
    1.1.2 道地药材与与植物抗氧化代谢  11-12
    1.1.3 逆境与植物抗氧化代谢  12-14
  1.2 黄酮类化合物生物合成和调控机制  14-17
    1.2.1 黄酮类化合物生物合成途径  14-15
    1.2.2 黄酮类化合物生物合成调控机制  15-17
  1.3 黄芩概述  17-20
    1.3.1 化学成分研究  18
    1.3.2 药理活性研究  18-19
    1.3.3 生物技术在研究黄芩中的运用  19-20
  1.4 本课题研究目的意义、主要内容、技术路线及创新要点  20-23
第2章实验材料和方法  23-33
  2.1 实验材料及处理方法  23
  2.2 新基因的克隆  23-28
    2.2.1 总RNA 抽提  23-24
    2.2.2 总RNA 逆转录  24-25
    2.2.3 基因克隆  25-28
  2.3 基因表达水平研究  28-29
    2.3.1 总RNA 抽提  28
    2.3.2 cDNA 模板制备与引物合成  28-29
    2.3.3 目的基因的半定量PCR 分析  29
  2.4 黄酮类成分含量测定  29-30
    2.4.1 实验仪器与色谱条件  29-30
    2.4.2 标准曲线的建立与方法学考察  30
    2.4.3 样品测定前处理  30
  2.5 内源激素含量测定  30-31
    2.5.1 激素提取  30-31
    2.5.2 激素的酶联免疫法（ELISA）检测  31
  2.6 数据处理与统计分析  31
  2.7 仪器、耗材和试剂  31-33
    2.7.1 实验仪器和耗材  31-32
    2.7.2 试剂  32-33
第3章实验结果  33-58
  3.1 新基因的克隆和序列结果  33-37
    3.1.1 总RNA 质量分析  33
    3.1.2 RNA 解旋酶和Clp 蛋白酶基因的扩增  33-34
    3.1.3 序列测定结果  34-35
    3.1.4 同源性检索和序列比对  35-37
  3.2 温度对中黄酮类成分积累、抗氧化及相关基因表达的影响  37-46
    3.2.1 黄芩根和叶中黄酮类成分积累动态测定结果  37-39
    3.2.2 黄芩根中H_2O_2 和抗氧化系统酶动态测定结果  39-42
    3.2.3 相关基因转录水平的检测  42-46
  3.3 土壤缺水对黄酮成分积累、抗氧化及相关基因表达的影响  46-53
    3.3.1 黄芩根和叶中黄酮类成分积累动态测定结果  46-48
    3.3.2 黄芩根中H_2O_2 和抗氧化系统酶动态测定结果  48-50
    3.3.3 相关基因转录水平的检测  50-53
  3.4 植物生长调节剂对悬浮细胞内源激素及黄酮成分积累的影响  53-58
    3.4.1 黄芩悬浮细胞黄芩苷和黄芩素含量测定结果  53-56
    3.4.2 黄芩悬浮细胞内源激素含量测定结果  56-58
第4章讨论  58-66
  4.1 温度对黄芩中黄酮类成分积累的影响及分子机制  58-60
  4.2 土壤水分对黄芩中黄酮类成分积累的影响及分子机制  60-63
  4.3 植物生长调节剂对悬浮细胞黄酮类成分含量的影响及机制  63-66
第5章结论  66-68
参考文献  68-73
致谢  73-74
附图  74-76
攻读学位期间的研究  76

从抗氧化代谢途径对黄芩品质形成“逆境效应”的研究

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