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旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的研究

作　者: 张胜力
导　师: 王中全
学　校: 郑州大学
专　业: 病原生物学
关键词: 旋毛虫伪旋毛虫肌幼虫可溶性抗原 ES抗原 SDS-PAGE 2-DE
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目前,国际上已将旋毛虫属分为8个种,即旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T.native,T2）、布氏旋毛虫（T.britovi,T3）、伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）、米氏旋毛虫（T.murrelli,T5）、纳氏旋毛虫（T.nelsoni,T7）、巴布亚旋毛虫（T.papuae,T10）、津巴布韦旋毛虫（T.zimbabwensis,T11）以及3个分类地位尚未确定的基因型（genotype）即Trichinella T6、T8和T9。其中伪旋毛虫、巴布亚旋毛虫和津巴布韦旋毛虫为无囊包的旋毛虫。由于不同种旋毛虫的地理分布、宿主范围、对宿主的致病性及宿主对不同虫种的免疫应答等方面存在有明显差异,故旋毛虫抗原的研究对旋毛虫病的发病机理、免疫诊断及免疫预防等均具有重要意义。为了观察旋毛虫和伪旋毛虫抗原的差异,本文应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和双向电泳技术（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）对旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫的虫体可溶性抗原（soluble antigen,Sag）及排泄分泌（excretory-secretory,ES）抗原进行了分析。材料与方法1.旋毛虫种与感染动物本实验所用的旋毛虫虫种为旋毛虫（T1）和伪旋毛虫（T4）,均引自国际旋毛虫参考中心,由本教研室昆明小鼠传代保种。4周龄健康雄性SD大鼠购自郑州大学医学院实验动物中心。将不同旋毛虫虫种感染SD大鼠后8周处死,全身肌肉人工消化后收集纯净的肌幼虫。2.肌幼虫可溶性抗原与ES抗原的制备将人工消化后收集纯净的旋毛虫肌幼虫加入组织裂解液,放入匀浆器中在冰浴上研磨约1～2h,随后在超声波细胞粉碎机破碎,离心收集上清。将纯净的旋毛虫肌幼虫置于含有1640培养基（不含血清）的培养皿中,在5%CO₂培养箱中培养20～24h,收集上清,透析和冷冻干燥后得到纯化ES抗原。Bradford方法测蛋白浓度后,分装,—80℃保存。3.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将制备好的T1、T4肌幼虫可溶性抗原和ES抗原进行SDS-PAGE,染色后观察不同分子量的电泳条带,然后用GeneGenius凝胶图像分析仪获得图像并加以分析,寻找T1和T4的差异蛋白带。4.双向电泳（2-DE）应用等电聚焦（IEF）电泳和SDS-PAGE将T1、T4肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的蛋白分离,每种样品重复3次,染色后得到蛋白双向电泳图谱,应用PowerLook 1120型图像扫描仪（分辨率为300bpi,像素8bits）获得凝胶图像,经ImageMaster 2D Platinum 6.0凝胶图像分析软件进行图像调整、点检测、点匹配、数据分析后,找出差异蛋白点。结果1.T1、T4肌幼虫可溶性抗原的SDS-PAGE结果通过SDS-PAGE分析,发现T1肌幼虫可溶性抗原蛋白有22条带（221.62 kDa～14.88 kDa）,其中主带5条（115.19、65.56、53.93、29.08、14.88 kDa）的蛋白量占可溶性抗原蛋白总量的47.4%。T4肌幼虫可溶性抗原蛋白有18条带（185.28 kDa～14.27 kDa）,其中主带7条（119.30、68.56、56.1、48.50、40.74、28.36、14.27 kDa）的蛋白量占可溶性蛋白总量的66.7%。T1肌幼虫可溶性抗原具有6条特异的蛋白带（59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34 kDa）,而T4肌幼虫可溶性抗原具有4条特异的蛋白带（132.60、119.30、35.26、31.02 kDa）。2.T1、T4肌幼虫ES抗原的SDS-PAGE结果通过SDS-PAGE分析,发现T1肌幼虫ES抗原具有10条蛋白带（113.21 kDa～14.37 kDa）,其中4条主带（55.65、50.41、43.61、14.37 kDa）的蛋白量占ES抗原蛋白总量的85.7%。T4肌幼虫ES抗原9条蛋白带（104.71kDa～14.51 kDa）,其中4条主带（54.58、36.80、21.70、14.51 kDa）的蛋白量占ES抗原蛋白总量的81.3%。T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同。3.T1、T4肌幼虫可溶性抗原、ES抗原的SDS-PAGE结果比较T1肌幼虫可溶性抗原的8条蛋白带（115.19、53.94、48.97、44.37、29.08、22.36、19.27、14.88 kDa）与ES抗原的8条蛋白带（113.21、55.65、50.41、43.61、31.42、22.21、19.67、14.37 kDa）分子量相近。T4肌幼虫可溶性抗原的5条蛋白带（56.11、35.26、28.36、20.65、14.27 kDa）与ES抗原的5条蛋白带（54.58、36.80、28.91、21.70、14.51 kDa）分子量相近。4.T1、T4肌幼虫可溶性抗原的双向电泳结果T1肌幼虫可溶性抗原具有193±12个蛋白点,匹配点数为150个,匹配率为81%,分子量主要为11～22 kDa、25～64 kDa及100～144 kDa,所对应的等电点（isoelectric point,pI）分别为4.7～8.2、4.5～6.5及5～7;T4肌幼虫可溶性抗原具有175±9个蛋白点,匹配点数为141个,匹配率为82%,分子量主要为12～21 kDa及25～90 kDa,所对应的pI分别为4～9.5及4.5～9.6。5.T1、T4肌幼虫ES抗原的双向电泳结果T1肌幼虫ES抗原具有82±6个蛋白点,匹配点数为74个,匹配率为84%,分子量主要为13～16 kDa、18～22 kDa及40～55 kDa,所对应的p1分别为4～7、3.8～6.2及5～9;T4肌幼虫ES抗原69±5个蛋白点,匹配点数为57个,匹配率为80%,分子量主要为10～15 kDa、17～25 kDa及29～55 kDa,所对应的pI分别为4.7～6.5、4.6～6及5～7。结论1.旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫可溶性抗原蛋白组份均多于其ES抗原。2.旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组份与伪旋毛虫的均不相同。旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组份均比伪旋毛虫的复杂。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-11
1 前言  11-14
  1.1 旋毛虫和旋毛虫病的简介  11
  1.2 旋毛虫肌幼虫抗原  11-13
  1.3 本实验研究的目的及意义  13
  1.4 本研究主要技术路线图  13-14
2 材料  14-19
  2.1 主要试剂  14
  2.2 主要仪器  14-16
  2.3 主要试剂的配置  16-19
  2.4 实验动物  19
  2.5 旋毛虫种  19
3 方法  19-26
  3.1 旋毛虫感染动物  19
  3.2 旋毛虫肌幼虫的收集  19-20
  3.3 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的制备  20-21
  3.4 蛋白定量  21-22
  3.5 等电聚焦  22-23
  3.6 第2向SDS-PAGE电泳  23-24
  3.7 胶体染色法染色  24
  3.8 胶图像扫描和分析  24-25
  3.9 SDS-PAGE电泳  25-26
4 实验结果  26-39
  4.1 样品蛋白的获取和浓度测定  26-27
  4.2 T1、T4肌幼虫可溶性抗原的SDS-PAGE结果  27-29
  4.3 T1、T4肌幼虫ES抗原的SDS-PAGE结果  29-31
  4.4 T1肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的SDS-PAGE结果  31
  4.5 T4肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的SDS-PAGE结果  31-32
  4.6 T1、T4肌幼虫的可溶性抗原的双向电泳结果  32-33
  4.7 T1、T4肌幼虫ES抗原的双向电泳结果  33-35
  4.8 T1肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的双向电泳结果  35
  4.9 T4肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的双向电泳结果  35-39
5 讨论  39-45
  5.1 双向电泳常见的问题  39-43
  5.2 T1、T4肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的SDS-PAGE  43-45
  5.3 T1、T4肌幼虫可溶性抗原和ES抗原的2-DE  45
6 结论  45-46
参考文献  46-51
综述  51-72
英文缩写词索引  72-73
致谢  73

旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的研究

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