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细胞骨架相关蛋白在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用研究

作　者: 胡玲玲
导　师: 汤其群
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 骨形成蛋白多潜能干细胞前脂肪细胞定向lox tpt1 crystallinαB
分类号: R589.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脂肪组织是人体重要的能量贮存器官。当能量摄取大于消耗时,就容易产生肥胖,导致脂肪组织体积的增大。脂肪组织体积的增大,一方面是由于脂肪细胞数目的增多；另一方面是由于脂肪细胞体积的增大。脂肪细胞起源于血管基质中多潜能干细胞,这类干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,在合适的条件下,可以分化为脂肪细胞、肌肉细胞、软骨细胞和成骨细胞等中胚层来源的细胞。从多潜能干细胞到脂肪细胞的发育可以分为三个阶段：1)向脂肪细胞系的定向；2)有丝分裂克隆扩增；3)终末分化。目前对于前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的分化研究的比较深入,而对于多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的过程了解甚少。在本课题中,我们主要通过蛋白质组学的方法来筛选在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程发挥作用的关键因子并进行机制的研究,弥补这一部分研究的空白。Tang等研究表明骨形成蛋白BMP2/4都能促进C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向,主要是通过与BMPR1A结合,激活Smad和p38信号通路从而导致多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向。但是对于Smad和p38信号通路激活后调节哪些关键基因而导致多潜能干细胞向前脂肪细胞定向并不明确。通过蛋白质组学研究,我们发现与未处理的细胞相比,用BMP2诱导定向的C3H10T1/2细胞中有8个蛋白表达上调；用BMP4处理后有28个蛋白上调；而其中有5个蛋白是BMP2或者BMP4处理后表达皆上调10倍以上的蛋白质。在这5个蛋白质中有3个是细胞骨架相关蛋白：赖氨酰氧化酶(1ox)、晶体蛋白αB (crystallin alpha B)和肿瘤翻译调控蛋白1(tptl)。我们从蛋白质水平进行了验证,确认了这三个蛋白在BMP2/4诱导定向的C3H10T1/2细胞中表达明显增加。为了进一步研究筛选出的lox、tptl和(?)crystallinαB与BMP信号通路的关系,我们利用RNA干扰方法下调特定蛋白质(Smad4和P38 MAPK)阻断Smad和p38信号通路,观察Smad和p38信号通路对lox、tptl和crystallinαB三种骨架相关蛋白表达的影响。结果显示下调Smad4蛋白水平能够抑制lox和crystallinαB的表达,但p38下调以后对lox和crystallinαB的表达的抑制作用相对较弱。说明Smad信号通路在lox和crystallinαB的诱导表达中发挥更重要的作用。而对于tptl来说,Smad4和p38用RNAi敲低之后tptl的表达水平有着相同程度的下调。而同时敲低Smad4和p38几乎完全阻断了lox、tpt1和crystallinαB的表达。这些结果说明了lox、tpt1和crystallinαB是BMP信号通路的下游靶基因。为了进一步确定lox、tpt1和crystallinαB在C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用,我们利用RNA干扰的方法下调C3H10T1/2多潜能干细胞lox、tpt1和crystallinαB蛋白水平,再给予细胞BMP2/4处理维持至细胞接触抑制后2天,来观察lox, tpt1和crystallinαB对BMP引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的影响。我们发现lox下调后几乎完全抑制了BMP2/4引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向,而tptl或者crystallinαB下调也部分抑制了BMP2/4引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向。说明BMP2/4诱导C3H10T1/2细胞向前脂肪细胞定向过程中lox, tpt1和crystallinαB均发挥作用。而lox在这个过程的作用尤为重要。同时我们还采用逆转录病毒表达系统在C3H10T1/2细胞中过表达lox,细胞接触抑制2天后用脂肪细胞标准分化流程进行诱导分化,我们发现过表达lox的C3H10T1/2细胞不足以使多潜能干细胞向前脂肪细胞定向。这个结果表明,lox并不是C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪定向的一个充分条件。有文献报道细胞的形态和细胞外基质的重塑在脂肪细胞系的定向和分化发育过程中起着重要作用,而细胞骨架在很大程度上影响着细胞形态的形成和维持。我们筛选出的三个骨架相关蛋白中lox能够将细胞外基质胶原和弹性蛋白的赖氨酸残基脱氨形成分子间的交联,稳定细胞外基质,保持细胞外基质内环境稳定。而tptl和crystallinαB则与细胞骨架有密切联系。在研究过程中,我们发现在BMP2/4诱导脂肪细胞系定向的过程中细胞的形态发生明显改变,细胞由纺锤形变为圆形且边缘变亮。因此我们用纤维形肌动蛋白F-actin特异性荧光染料鬼笔环肽来观察BMP2/4诱导定向的C3H10T1/2细胞中细胞骨架的排列情况。结果显示未定向的细胞中F-actin是以长线型的束状应力纤维的形式存在。而定向的细胞中F-actin形成的应力纤维明显降低,其束状排列也被打断,纤维丝成块或成堆围绕在细胞的边缘。而用RNAi技术下调细胞骨架相关蛋白lox、tpt1和crystallinαB的水平后可以恢复未定向时细胞的形态以及F-actin应力纤维的排列。这些数据表明,细胞形态的改变可能是BMP2/4诱导多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的分子机制之一。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-12
材料和方法  12-26
结果  26-41
讨论  41-43
结论  43-44
参考文献  44-49
缩写表  49-51
综述  51-59
  参考文献  56-59
发表论文  59-60
致谢  60-61

细胞骨架相关蛋白在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用研究

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