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鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的表达纯化及药理活性研究

作　者: 严守升
导　师: 田育望；陈守春
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 鲑鱼降钙素内蛋白子酰胺化大肠杆菌重组
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 24次
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内容摘要

降钙素(calcitonin, CT)是一类重要的多肽类激素,在钙、磷代谢,骨骼的形成、分化和发育等多个环节有重要的作用,特别是鲑鱼降钙素(salmon calcitonin, sCT)在临床上有十分重要用途。sCT和许多多肽C末端的酰胺化对其生物学功能有重要的作用,但是这种酰胺化修饰在原核表达系统很难完成,表达的前体蛋白需要在细胞外经过酶的修饰才具有生物活性。为了用大肠杆菌制备有生物活性的sCT,在本研究中我们采用含有内蛋白子(Intein)的表达系统,在Intein剪切过程中,加入提供NH3的试剂达到酰胺化的目的。本文利用半化学半酶促法获得大肠杆菌密码子偏嗜的sCT基因,将sCT基因克隆入含有Intein的大肠杆菌融合型表达载体pTWIN 1中。重组表达载体转到大肠杆菌ER2566中,表达条件优化后,经发酵罐流加发酵,破菌,然后将表达的融合蛋白经CBD亲合柱纯化,并且在亲和柱上一步完成Intein介导的目的蛋白的剪切和C末端的酰胺化。获得的sCT进一步的分离纯化得到初级纯品,通过观察其对破骨细胞活动的抑制和大鼠降血钙试验来初步检测其生物活性。结果表明大肠杆菌重组的sCT融合蛋白经inein介导的剪切和酰胺化后,具有与化学合成的sCT相同的理化特征,并具有显著的降低大鼠血钙的活性,如果进一步优化工艺有望用于工业化生产。

全文目录

中文摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
引言  7-8
第1部分概述  8-18
  1.1.国内外研究的现状  8-13
    1.1.1.降钙素的结构与性质  8-10
    1.1.2.降钙素的制备  10-11
    1.1.3.降钙素的药理作用、作用机制及临床应用  11-13
  1.2.本文主要内容和技术路线  13-18
第2部分工程菌的构建  18-31
  2.1.材料  18-19
  2.2.方法  19-25
    2.2.1.插入的DNA片断的制备  19-24
    2.2.2.表达质粒pTWIN-1/sCT的构建  24-25
  2.3.结果  25-27
    2.3.1.插入DNA片段的制备  25-26
    2.3.2.表达质粒pTWIN-1/sCT的构建  26-27
  2.4.分析与讨论  27-31
第3部分工程菌的发酵  31-44
  3.1.材料  31-32
  3.2.方法  32-38
    3.2.1.摇瓶发酵的优化  32-33
    3.2.2.菌体收获  33
    3.2.3.破菌  33
    3.2.4.目的蛋白的定量和鉴定分析  33-37
    3.2.5.流加发酵  37-38
  3.3.结果  38-41
    3.3.1.摇瓶发酵的优化  38-39
    3.3.2.Western Blotting分析  39-40
    3.3.3.流加发酵  40-41
  3.4.分析与讨论  41-44
第4部分目的蛋白的纯化和鉴定  44-51
  4.1.材料  44
  4.2.方法  44-46
    4.2.1.目的蛋白的剪切、修饰及纯化  44-46
    4.2.2.目的蛋白的理化鉴定  46
  4.3.结果  46-48
    4.3.1.目的蛋白的纯化  46-47
    4.3.2.目的蛋白的定性和纯度鉴定  47-48
    4.3.3.目的蛋白的等电点测定  48
  4.4.分析与讨论  48-51
第5部分药理活性的初步检测  51-56
  5.1.材料  51
  5.2.方法  51-53
    5.2.1.对大鼠破骨细胞活动的影响  51-53
    5.2.2.大鼠血清钙降低法  53
  5.3.结果  53-55
    5.3.1.对大鼠破骨细胞的作用  53-54
    5.3.2.对大鼠血清钙的影响  54-55
  5.4.分析与讨论  55-56
结论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-59

鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的表达纯化及药理活性研究

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