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光学活性重组别藻蓝蛋白的初步研究

作　者: 杨雨
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 基因重组别藻蓝蛋白光学活性荧光
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 105次
引　用: 2次
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内容摘要

藻胆蛋白是某些原核和真核藻类中一类重要的捕光天线蛋白，由脱辅基蛋白和开环四吡咯结构的色基共价结合组成。天然藻胆蛋白具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎抗氧化等多种生物活性，而借助基因工程技术可以高效表达构效稳定的藻胆蛋白，应用于医药、食品、生化试剂等领域。本研究在本实验室以前研制的抗肿瘤新药雷普克（rAPC）以及光学活性重组C-藻蓝蛋白α亚基的基础上，将别藻蓝蛋白α亚基基因apcA连入表达载体pCDFDuet-1中，构建了酶催化连接与自主催化连接两种新型载体，使大肠杆菌同时合成脱辅基蛋白与色基，而且二者能够在菌体内结合，表达出具有光学活性的重组别藻蓝蛋白α亚基。以重组菌BL21（DE3）作为研究对象，对酶催化连接的重组蛋白进行了5L规模的发酵，菌体密度OD₆₀₀值达到23.52，并初步优化了发酵工艺，摸索了如何减少发酵过程中包涵体的生成。采用金属螯合亲和层析的方法，建立了重组蛋白快速高效的纯化工艺。对比两种重组蛋白的光谱活性，发现藻蓝蛋白裂合酶的存在影响了重组蛋白的荧光吸收特性，推测藻胆蛋白的荧光特性可能是主要由脱辅基蛋白和色基空间构象决定，而不是肽链的一级结构。这些研究结果为解释藻胆蛋白荧光活性的机制提供了线索。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-10
第一章引言  10-27
  1 藻胆蛋白的结构与进化  10-17
    1.1 藻胆蛋白的结构  10-15
    1.2 藻胆蛋白的进化  15-17
  2 藻胆蛋白的生物学活性  17-21
    2.1 抗肿瘤活性  17-18
    2.2 抗病毒活性  18
    2.3 血细胞增殖及免疫刺激活性  18-19
    2.4 抗氧化和抗炎活性  19-20
    2.5 光致细胞毒活性  20-21
  3 藻胆蛋白的应用  21-23
    3.1 饲料  21-22
    3.2 天然色素  22
    3.3 荧光标记  22-23
    3.4 药物及保健品  23
  4 藻胆蛋白基因工程  23-27
    4.1 重组脱辅基藻胆蛋白  24-25
    4.2 重组光学活性藻胆蛋白  25-27
第二章光学活性重组别藻蓝蛋白相关基因在大肠杆菌中的表达  27-39
  1 材料与方法  27-34
    1.1 基因、表达载体和菌株  27
    1.2 生化试剂  27-28
    1.3 常用溶液的配制  28-29
      1.3.1 培养基  28
      1.3.2 抗生素和诱导剂  28
      1.3.3 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液  28-29
    1.4 实验方法  29-34
      1.4.1 表达载体的构建  30-33
      1.4.2 apcA基因在大肠杆菌中的表达  33-34
      1.4.3 目的蛋白分析  34
  2 结果与分析  34-37
    2.1 表达载体的构建  35-36
      2.1.1 重组子酶切鉴定  35-36
      2.1.2 测序验证  36
    2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达  36-37
  3 讨论  37-38
  4 本章小结  38-39
第三章重组菌的发酵培养及重组蛋白的分离纯化  39-55
  1 材料与方法  39-45
    1.1 质粒和菌株  39
    1.2 主要试剂  39-40
    1.3 主要溶液的配制  40-41
      1.3.1 培养基  40
      1.3.2 抗生素和诱导剂  40
      1.3.3 SDS-PAGE相关溶液  40
      1.3.4 柱层析缓冲液  40-41
      1.3.5 蛋白印记免疫分析试剂  41
    1.4 实验方法  41-43
      1.4.1 菌种的平板保存  41-42
      1.4.2 试管及摇瓶培养  42
      1.4.3 发酵罐培养  42
      1.4.4 重组蛋白的分离  42
      1.4.5 金属螯合亲和层析  42-43
      1.4.6 纯化后蛋白样品保存  43
    1.5 检测方法  43-45
      1.5.1 菌体浓度的测定  43-44
      1.5.2 重组蛋白表达水平分析  44
      1.5.3 重组蛋白抗原性分析—Western blotting分析  44-45
      1.5.4 重组蛋白溶解性分析  45
  2 结果与分析  45-52
    2.1 摇瓶条件的确定  45-48
      2.1.1 培养基不同氮源对产物表达的影响  46
      2.1.2 IPTG诱导时机对产物表达的影响  46-47
      2.1.3 IPTG诱导浓度对产物表达的影响  47-48
    2.2 高密度发酵条件的确定  48-50
      2.2.1 补料时机及方式的选择  48
      2.2.2 诱导时机的选择  48-50
    2.3 金属螯合亲和层析  50
    2.4 重组蛋白表观特征与溶解性  50-51
    2.5 重组蛋白的Western blotting分析  51-52
  3 讨论  52-53
  4 本章小结  53-55
第四章两种重组蛋白光谱性质的比较  55-65
  1 材料与方法  55-58
    1.1 质粒和菌株  55
    1.2 主要试剂  55
    1.3 主要配制溶液  55-56
    1.4 实验方法  56-58
      1.4.1 自主连接重组表达载体的构建  56-58
      1.4.2 自主连接重组蛋白的摇瓶诱导培养  58
      1.4.3 自主连接重组蛋白的分离纯化  58
      1.4.4 两种重组蛋白的光谱分析  58
  2 结果与分析  58-63
    2.1 自主连接重组蛋白表达载体的构建  58-61
      2.1.1 重组子酶切鉴定  58-60
      2.1.2 测序验证  60-61
    2.2 自主连接重组蛋白的表达纯化  61
    2.3 两种重组蛋白光谱性质的比较  61-63
      2.3.1 可见光区吸收光谱性质  61-62
      2.3.2 荧光光谱性质  62-63
  3 讨论  63-64
  4 本章小结  64-65
参考文献  65-78
仪器  78-79
在研期间发表和完成论文情况  79-81
致谢  81

光学活性重组别藻蓝蛋白的初步研究

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