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王浆高产与意大利蜜蜂工蜂幼虫期蛋白质组研究

作　者: 陈健
导　师: 李建科
学　校: 郑州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 原种意大利蜜蜂(A.m.ligustica) 王浆高产蜜蜂(A.m.ligustica) 工蜂幼虫双向电泳蛋白质组
分类号: S891
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

王浆高产蜜蜂(A.m.ligustica,浆蜂)是我国从原种意大利蜜蜂(A.m.ligustica,意蜂)选育成功的蜂王浆高产蜂种,它是目前世界上产浆量最高的蜂种。利用蛋白质组学方法从分子水平研究它们在幼虫发育期的蛋白质组异同,将对解释产浆性状的差异和拓展蜜蜂生物学奠定基础。通过比较浆蜂与意蜂工蜂幼虫期蛋白组,结果发现在幼虫期2日龄,浆蜂的蛋白表达谱为284个蛋白,意蜂为246个蛋白,两蜂种共有蛋白点为218个,而浆蜂特异蛋白为46个,而意蜂特异蛋白为28个;幼虫4日龄时,浆蜂总蛋白点数为315个,意蜂总蛋白点数为278个蛋白,两蜂种共有蛋白点为240个,而浆蜂特异蛋白为65个,意蜂特异蛋白为38个;到达幼虫6日龄时,浆蜂蛋白组含244个蛋白,意蜂蛋白质组含211个蛋白,两蜂种共有蛋白点为187个,而浆蜂特异蛋白为37个,意蜂特异蛋白为24个。在蜜蜂幼虫期浆蜂较意蜂表达的蛋白总数和特有蛋白多,说明经选育的浆蜂较意蜂幼虫的基因表达和代谢更加旺盛。在2蜂种幼虫期表达的共有蛋白中,其中一些蛋白的表达量存在差异,而2蜂种在3个日龄所表达的特有蛋白的数和量也存在一定差异,这些说明幼虫发育需要管家蛋白和不同发育阶段相应的特定蛋白来调控,但管家蛋白和特有蛋白在2蜂种的表达模式存在差异。在蛋白质组表达谱分析的基础上,利用MAILDI-TOF/MS、MAILDI-TOF-TOF/MS、MASCOT检索引擎和生物通路分析方法对意蜂表达谱中的蛋白进行功能鉴定和生化通路分析。其2、4、6日龄蛋白谱中的分别有101、97、71个已成功得到鉴定,按功能可分为八大类:分别是生物代谢类、抗氧化类、营养蛋白类、蛋白折叠类、发育相关类蛋白、转录及翻译类调控类因子、细胞骨架类以及外源蛋白类。统计分析表明,这些功能蛋白中有57个表达量差异显著。对其中16个蛋白进行荧光定量PCR验证,结果显示有7个在mRNA水平与蛋白表达水平相一致。通路分析表明,在所有鉴定的蛋白中,有24个蛋白是幼虫发育中的节点蛋白,他们是:HSP 60,imaginal disc growth factor 4,heat shock 70 kDaprotein 1 beta,translation elongation factor 1-gamma,enolase,ATP synthase beta subunit,guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein,lethal(2)37Cc,proteindisulfide-isomerase,triose phosphate isomerase,aldehyde reductase,transketolase,Hspcognate 3,bellwether,thioredoxin peroxidase 1,translationally controlled tumor protein,fatty acid binding protein,aldolase,leonardo,elongation factor 1-alpha F2,HSP cognate5,HSP 8。这表明幼虫发育需要不同种类的功能蛋白相互配合,通过顺序开启和关闭一些基因的表达时间和表达量来完成幼虫的发育,其中高能量代谢和大量营养储存是幼虫发育最显著的特点。这些节点蛋白是对幼虫发育其至关重要的作用,并且这些节点蛋白也为今后的蜜蜂转基因操作提供了靶点。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-9
引言  9-10
第一章文献综述  10-14
  1.1 王浆高产蜜蜂研究综述  10
  1.2 蜜蜂幼虫期研究综述  10-13
  1.3 选题意义及取得的进展  13-14
    1.3.1 选题意义  13
    1.3.2 取得的进展  13-14
第二章王浆高产蜜蜂与原种意大利蜜蜂幼虫期蛋白质组比较  14-24
  2.1 材料与方法  14-18
    2.1.1 试剂  14
    2.1.2 仪器  14-15
    2.1.3 取样  15
    2.1.4 幼虫全蛋白提取  15-16
    2.1.5 蛋白浓度测定  16
    2.1.6 绘制标准曲线  16-17
    2.1.7 样品浓度测定  17
    2.1.8 双向电泳(2-DE)  17
    2.1.9 图像分析  17-18
  2.2 结果与分析  18-22
    2.2.1 浆蜂与意蜂工蜂幼虫期2-DE电泳图谱  18-19
    2.2.2 浆蜂与原意工蜂2日龄幼虫期蛋白比较  19-20
    2.2.3 浆蜂与原意工蜂4日龄幼虫期蛋白比较  20-21
    2.2.4 浆蜂与原意工蜂6日龄幼虫期蛋白比较  21-22
  2.3 讨论  22-24
第三章原种意大利蜜蜂工蜂幼虫期不同日龄蛋白组分析  24-28
  3.1 材料和方法  24
  3.2 结果与分析  24-27
    3.2.1 原种意大利蜜蜂工蜂幼虫期发育2-DE蛋白表达图谱  24-25
    3.2.2 原种意大利蜜蜂工蜂幼虫期发育不同日龄蛋白质组比较  25-27
  3.3 讨论  27-28
第四章原种意大利蜜蜂工蜂幼虫期不同日龄蛋白组功能鉴定  28-57
  4.1 材料与方法  28-31
    4.1.1 试剂  28-29
      4.1.1.1 试剂来源  28-29
      4.1.1.2 试剂配制  29
        4.1.1.2.1 脱色液(现用现配)  29
        4.1.1.2.2 酶解液  29
        4.1.1.2.3 5%三氟乙酸  29
        4.1.1.2.4 2.5%三氟乙酸+50%乙腈混合液  29
    4.1.2 仪器  29-30
    4.1.3 方法  30
    4.1.4 荧光定量PCR验证  30-31
  4.2 结果与分析  31-52
    4.2.1 不同发育时期的的原种意大利蜜蜂幼虫的蛋白组双向电泳图谱  31-38
      4.2.1.1 已鉴定出的部分蛋白肽指纹图谱  33-38
    4.2.2 不同日龄所鉴定出的全蛋白功能分类  38-48
      4.2.2.1 不同日龄所鉴定出的全蛋白功能分类饼状图  38-39
      4.2.2.2 已鉴定出的三个日龄所有蛋白按功能分类表  39-48
    4.2.2 所鉴定出的在三个日龄有表达量显著差异的蛋白柱状图  48-49
    4.2.3 生化通路分析  49-52
  4.3 讨论  52-57
结论  57-59
参考文献  59-69
致谢  69

王浆高产与意大利蜜蜂工蜂幼虫期蛋白质组研究

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