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圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪的研制及应用评价

作　者: 裴海闰
导　师: 曹学丽
学　校: 北京工商大学
专　业: 生物化工
关键词: 高速逆流色谱圆盘嵌入式螺旋管柱双水相体系蛋白质多肽花青素
分类号: O657.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

高速逆流色谱是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术,它基于高速旋转所产生的离心力实现液态固定相的高效保留。目前常用的高速逆流色谱仪都采用J型多层缠绕的聚四氟乙烯螺旋管分离柱设计。该仪器对常用两相溶剂体系都能够实现有效保留,并用于样品的分离。特别是采用弱极性到中极性两相体系成功应用于天然产物中活性小分子化合物的分离。然而,该种高速逆流色谱仪对分离极性化合物及水溶性生物大分子所需要的强极性两相溶剂体系和高粘度、低界面张力的双水相溶剂体系的保留率极低,极大的限制了逆流色谱在该方面的应用。由于高速逆流色谱仪是利用螺旋管色谱柱在行星式运动过程中产生的阿基米德螺旋力实现固定相的保留,因此可以通过扩大螺旋管的盘绕螺距来提高固定相的保留率。在传统的多层缠绕的螺旋管柱逆流色谱仪中,螺距受到螺旋管外径的限制,由里到外离心力的增长速率缓慢,因而对一些极性强、粘度高的溶剂体系保留能力较弱。近年来,一种在圆盘刻蚀螺旋槽的方式被应用于高速逆流色谱分离柱的设计,可使螺旋槽的螺距明显增加。本论文设计并研制了一种圆盘嵌入式螺旋管柱高速逆流色谱仪,它通过在一个圆柱形圆盘上设置螺旋槽,并在其中嵌入多层螺旋管的方式设计了一种新型的逆流色谱分离柱;通过一系列试验就其对不同溶剂体系的保留能力进行了评价,同时与传统高速逆流色谱仪的保留能力进行了比较;并将其初步应用于茶黄素、花青素、二肽和蛋白类大分子等多种实际样品的分离,对其分离纯化能力进行了初步考察研究。首先,本文所研制的圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪采用双分离柱串联设计,公转半径为7.0cm,β值范围为0.3~0.7,柱总容积为30mL。分离柱的管路支撑体用UG设计,FDM快速成型,形成带有四螺旋槽的圆柱形柱体,然后将聚四氟乙烯螺旋管顺着螺旋槽逐层嵌入,通过增加螺距的方式,增强槽中螺旋管内流动液体的离心力梯度。将这种柱体分设在自行设计的行星架两侧,构成一种新型的J型逆流色谱仪。这种设计使其对极性溶剂体系和双水相体系的固定相的保留能力得到较大改善,并保持了其高的分离效率。其次,就所研制的新型分离柱对不同溶剂体系的保留能力进行了试验和评价。根据溶剂极性不同,分别选择了弱极性、中等极性、极性溶剂体系和双水相体系用于固定相保留能力的研究,其中包括正庚烷-甲醇、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、正丁醇-醋酸-水及聚乙二醇1000-磷酸钾盐-水双水相体系。分别试验了各溶剂体系在不同洗脱模式、不同流动相流速和不同转速(g-levels)下的固定相的保留率。其中洗脱模式由流动相、色谱柱转向和流动相的流动方向三种因素决定,共形成八种不同的洗脱模式。结果表明,圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪可使极性较弱的溶剂体系在以下相(L)为流动相时,采用从头(H)到尾(T)的洗脱模式(L-O-H、L-I-H)或在以上相(U)为流动相时,采用从尾(T)到头(H)的洗脱模式(U-I-T、U-O-T)可以获得较高的固定相保留率。正庚烷-甲醇体系和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系,在流速为1mL/min下,固定相保留率最高可以达到约70%,在流速为2mL/min下,固定相保留率可以达到55-60%,这对于弱极性到中等极性小分子物质的快速高效分离非常有利。对于极性较强的正丁醇-醋酸-水体系及双水相体系(聚乙二醇1000-磷酸钾盐-水体系),则表现出完全不同的另外一种保留规律,即以下相(L)为流动相时,采用从内(I)到外(O)的洗脱模式(L-I-T、L-I-H)或以上相(U)为流动相时,采用从外(O)到内(I)的洗脱模式(U-O-H、U-O-T)可以得到较高的固定相保留率。与螺旋管路的内外端是首段还是尾端无关。正丁醇-醋酸-水体系可实现60%保留率(0.5mL/min),聚乙二醇1000-磷酸钾盐-水体系可实现46%保留率(0.5mL/min)。所有溶剂体系的固定相保留率都会随着分离柱转速(g-levels)的提高而逐渐增加,并趋近于某一恒定值,但不同体系的变化起始点和变化速率不同。对于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系,随着g-levels的不断提高,其固定相保留率逐渐增加,达到80 g以上时固定相保留率趋于稳定。对于粘度较大的正丁醇-醋酸-水体系和PEG1000-磷酸盐体系,g-levels对固定相保留率的影响较为明显。对于正丁醇-醋酸-水体系,g-levels必须在100 g以上才能实现固定相保留率趋于恒定。另外通过与传统的多层缠绕的螺旋管柱逆流色谱仪对比,在最佳洗脱模式和相同流速下,不同g-levels条件下,圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪对固定相的保留率有明显的增加,尤其对于极性较强的正丁醇-醋酸-水体系和双水相体系,保留率提高约1.5倍,为该仪器的进一步开发和应用奠定了良好基础。第三,将所研制的新型逆流色谱仪初步应用于茶黄素、花青素、二肽和蛋白类大分子等多种实际样品的分离,对其实际分离纯化能力进行考察研究。采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系分离茶黄素混合物,在流速为2mL/min时仍可达到50%固定相保留率,并得到有效分离;花青素样品在甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸体系下同样得到有效分离。茶黄素和花青素等小分子化合物都在较高流速下得到有效分离,证明该圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪在植物和天然产物中小分子活性成分的高效快速分离制备方面具有重要意义。采用极性较强的正丁醇-醋酸-水体系,在0.5mL/min的流速下,成功分离了Leu-Tyr和Val-Tyr二肽样品。细胞色素C和肌红蛋白混合物、溶菌酶和肌红蛋白混合物在12.5% PEG1000-12.5% K2HPO4-75%水(pH= 9)溶剂体系中得到有效分离。以上结果证明圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪也适用于蛋白质等生物大分子样品的分离纯化。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-23
  1.1 高速逆流色谱简介  10-16
    1.1.1 高速逆流色谱的分离原理及特点  10-12
    1.1.2 逆流色谱发展  12-13
    1.1.3 目前高速逆流色谱柱体的设计  13-16
    1.1.4 高速逆流色谱工业化  16
  1.2 高速逆流色谱技术应用基础  16-18
    1.2.1 溶剂体系的选择  16-17
    1.2.2 固定相保留率  17-18
  1.3 高速逆流色谱技术应用现状  18-20
    1.3.1 天然产物和中药单体的分离  19
    1.3.2 食品功能性成分的制备分离  19-20
    1.3.3 抗生素的分离  20
    1.3.4 蛋白质等生物大分子的分离  20
  1.4 本论文研究目的及研究内容  20-23
第二章圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪的研制  23-31
  2.1 圆盘嵌入式螺旋管分离柱的设计加工  23-25
  2.2 J 型行星架及整机框架的设计与加工  25-26
  2.3 整机的安装与调试  26-29
    2.3.1 整机安装  26-28
    2.3.2 仪器机械稳定性调试  28-29
  2.4 与传统多层缠绕HSCCC 基本参数对比  29-31
第三章圆盘嵌入式螺旋管HSCCC 对不同溶剂体系的保留能力评价  31-42
  3.1 材料和方法  31-34
    3.1.1 实验试剂  31
    3.1.2 溶剂体系和洗脱模式  31-32
    3.1.3 固定相保留率的测定  32-33
    3.1.4 与传统HSCCC 保留能力对比  33-34
  3.2 结果与讨论  34-41
    3.2.1 不同溶剂体系在不同洗脱模式下的固定相保留率  34-38
    3.2.2 与传统HSCCC 保留能力对比  38-41
  3.3 本章小结  41-42
第四章圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪应用评价  42-54
  4.1 茶黄素样品的分离  42-44
    4.1.1 材料和方法  42-43
    4.1.2 结果和讨论  43-44
  4.2 黑果枸杞花青素样品的分离  44-49
    4.2.1 材料和方法  44
    4.2.2 结果与讨论  44-49
  4.3 小分子肽样品的分离  49-51
    4.3.1 材料和方法  50
    4.3.2 结果和讨论  50-51
  4.4 蛋白标品的分离  51-52
    4.4.1 材料和方法  51
    4.4.2 结果和讨论  51-52
  4.5 本章小结  52-54
第五章结论与创新点  54-56
参考文献  56-59
成果清单  59-60
致谢  60

圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪的研制及应用评价

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