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骨髓基质细胞移植治疗帕金森病的实验研究

作　者: 刘卓
导　师: 毛曦
学　校: 东南大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 骨髓基质细胞培养帕金森病移植大鼠神经干细胞神经营养因子全反式维甲酸诱导神经元
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

第一章自体骨髓基质细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究目的:将自体骨髓基质细胞(marrow stromal cells, MSCs)体外扩增后植入帕金森病(Parkinson disease, PD)大鼠的纹状体内,观察其在患鼠脑内的生存、分化、迁移等变化,以期为研究和治疗PD提供新的思路和新的方法。方法:将6-羟基多巴(6-OHDA)注入大鼠一侧黑质致密部(SNc)和中脑腹侧背盖区(VTA)内,建立PD样的动物模型。在PD大鼠胫骨处抽取骨髓后,从骨髓中分离出MSCs进行培养和扩增。在详细记录了每只PD大鼠的旋转次数后,用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, Brdu)标记扩增的MSCs,以细胞浓度为1×107/ml植入同种同体PD大鼠伤侧纹状体内。于术后7天、14天、21天、30天、60天腹腔注射阿朴吗啡(Apomorphine,APO)诱导PD大鼠的旋转行为,观察PD大鼠的行为学改变;取移植后存活7天、21天、2个月的PD大鼠的脑组织行Brdu免疫荧光和免疫组织化学单标检测,观察移植细胞的生存和迁移情况;行Brdu/胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和Brdu/神经原纤维(NF)抗体免疫组织化学双标检测,观察MSCs是否分化为星形胶质细胞和神经细胞。实验设立生理盐水替代细胞对照组和正常大鼠细胞移植对照组。结果:⑴PD大鼠模型的建立:PD大鼠模型恒定转向健侧,旋转次数>7r/min;H-E染色和TH免疫组化染色显示发现病鼠患侧SNc和VTA多巴胺能神经元的数目明显减少。⑵MSCs的分离、培养和标记:大鼠骨髓的MSCs体外培养两周后纯化,成梭形,平行排列或漩涡状生长。经细胞爬片Brdu免疫组化证实85%MSCs标记上Brdu。⑶MSCs脑内移植:脑切片Brdu免疫荧光加免疫组化染色结果显示移植初期,移植细胞呈簇状或串状沿针道分布,细胞数量较多,移植细胞向周围组织迁移,以移植区域为主。随着时间的推移,移植细胞逐渐向双侧纹状体、大脑皮层、海马、胼胝体、侧脑室、第三脑室等处迁移。⑷移植7天后,在许多Brdu+细胞的胞浆中可见到GFAP阳性产物,但是未观察到NF的阳性产物。⑸正常大鼠对照组移植细胞的存活、迁移、分化情况与PD组的结果相同,两组无统计学差异。⑹未移植PD模型组、MSCs移植组、生理盐水对照组的旋转实验显示,移植前后各组动物的旋转行为未见明显改善。⑺所有动物在移植两个月内未发现有肿瘤的形成。结论:在PD脑的微环境中,MSCs能向脑的许多部位进行迁移,并可分化为星形胶质细胞,MSCs用于PD细胞替代治疗有很大的可能性。但MSCs在PD脑的微环境中是否可以分化为神经细胞进而发挥功能改善PD的症状,尚有待于进一步研究。第二章:大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的实验研究目的:观察大鼠MSCs在维甲酸(Retinoic acid,RA)、RA联合胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)、与神经干细胞(neural stem cells, NSCs)共培养三种诱导条件下体外分化成神经细胞的能力,为其将来可能的临床应用提供理论和实验基础。方法:在大鼠胫骨处抽取骨髓后,从骨髓中分离出MSCs进行培养和扩增。取原代第五天的MSCs分别进行:A组:0.3ug/ml RA单独诱导MSCs;B组:0.3ug/ml RA联合20ng/ml GDNF诱导MSCs;C组:MSCs与已培养成球的NSCs共培养进行诱导,MSCs共培养之前行Brdu标记。诱导三天后免疫组织化学法检测各组贴壁细胞GFAP、NF、酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)表面标志的表达,以观察

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中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
缩略词表  9-10
前言  10-12
文献综述  12-22
第一章：自体骨髓基质细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究  22-40
  1. 材料和方法  22-27
    1.1 实验材料  22-23
    1.2 实验方法  23-27
  2. 实验结果  27-36
    2.1 PD 模型的制作  27-29
    2.2 自体MSCs 的分离、培养和标记  29-31
    2.3 移植细胞后PD 大鼠行为学检测  31-32
    2.4 脑内移植细胞形态学观察  32-36
  3. 讨论  36-38
  参考文献  38-40
第二章：大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的实验研究  40-57
  1. 材料和方法  40-43
    1.1 实验材料  40-41
    1.2 实验方法  41-43
  2. 实验结果  43-51
    2.1 大鼠 MSCs 原代培养  43
    2.2 NSCs 的培养及鉴定  43-45
    2.3 各诱导组MSCs 形态学观察  45-47
    2.4 各组诱导三天后MSCs 的分化情况  47-51
  3. 讨论  51-54
  结论  54-55
  参考文献  55-57
作者简介  57-58
致谢  58

骨髓基质细胞移植治疗帕金森病的实验研究

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