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百合AG类基因的同源克隆和分析

作　者: 缪红艳
导　师: 施季森
学　校: 南京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 百合 MADS-box AGAMOUS RT-PCR 花发育
分类号: S682.29
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 375次
引　用: 5次
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内容摘要

百合花姿优美，是世界鲜切花市场的五大主要产品之一。但在营销和消费过程中，花粉污染衣物和其他一些有价值的物品一直是一个缺憾。因此，通过调控百合花发育相关基因的表达，调控形态发生，改变百合的花器官的结构是近年花卉育种学家探索的重要领域。本研究基于这一基本目标，进行了百合花器官发育基因调控有关的基础研究，并对分子生物学的实验方法进行了改进。主要结论如下：从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的重要前提。百合的植物组织中富含多糖，多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携去除，造成RNA产量的减少，这就使得提取百合的RNA比较困难。本试验采用了五种方法(CTAB法、TRIZOL法、WI法、GT法和TRIS-SDS法)，对三个百合种试验材料(鲜切花、卷丹、麝香百合)进行了研究。鲜切花为市售东方百合产品，购回后用液氮冷萃后，-70℃保存备用。卷丹和麝香百合为实验室种质资源圃中收集的材料，开花时直接从植株上采下，于液氮冷萃后，-70℃保存备用。试验结果显示，CTAB、TRIZOL和WI法均不适合百合RNA的提取，TRIZOL法虽然操作简单，步骤少，但是得到的RNA不纯；CTAB法用于提取鲜切花根本提取不到RNA，用于提取卷丹和麝香百合时，也出现不同程度的降解；GT法虽然适合百合的提取，但是操作复杂，而且得到的RNA含量不高，效率很低。TRIS-SDS法既能提取到高质量的RNA，也能高效提取，并对不同品种的百合有普遍的通用性。经过改进的TRIS-SDS法，操作也比较简便，试验中一些试剂都可以自己配制，降低了试验费用。参照单子叶植物的AG类基因序列设计简并引物，利用RT-PCR的方法，从百合中扩增AG到同源片段，并根据扩增出的片段序列设计特异引物进行5’RACE和3’RACE的扩增，最终获得全长。本试验从百合中克隆得到了2个近全长的花发育相关基因片段LLAGM 1，2，它们都属于MADSbox基因家族，并和AG类基因有较高的同源性。 LLAGM1全长1000bp，编码243个氨基酸。LLAGM1的氨基酸序列与拟南芥AG的同源性为68.5％，与榛子CaMADS1的同源性为68.5％，与风信子HAG的同源性为73％，与百合LLAG1同源性为92.2％，与水稻OsMADS3的同源性为68.2％，与姬蝴蝶兰PeMADS1的同源性为71％，与矮牵牛pMADS3的同源性为68.8％。氨基酸序列比较可以看出，LLAGM1和LLAG1的M区完全相同，但是在K区存在18个不同的氨基酸序列，在C端有两个不同的氨基酸。 LLAGM2全长1168bp，编码249个氨基酸。LLAGM2与多种植物的AG类基因同源性较高。LLAGM1的氨基酸序列与拟南芥AG的同源性为64.1％，与榛子CaMADS1的同源性为64.6％，与风信子HAG的同源性为6.．6％，与百合LLAG1同源性为86.5％，与水稻OsMADS3的同源性为63.6％，与姬蝴蝶兰PeMADS1的同源性为68％，与矮牵牛pMADS3的同源性为65.3％。LLAGM2与LLAG1在K区有20个氨基酸不同，C末端也有较大差异。 LLAGM1和LLAGM2基因片段全长的K区和C区末端的这种差异，对于百合花发育的功能有待今后进一步深入研究。

百合AG类基因的同源克隆和分析

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