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邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对蚕豆幼苗发育的影响

作　者: 常青
导　师: 丁书茂
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DEHP 蚕豆微核氧化损伤 DNA多态性
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着人们对食品安全问题的关注,来自包装材料中的有害污染物日益受到重视。2007年6月7日,包括中国“老干妈”辣酱在内的10种亚洲食品,经瑞士苏黎世州检验中心检测后,被评定为不安全食品,并发布了禁售令,原因是这些食品包装中是用来PVC垫圈材料,而这些垫圈材料中含有大量的,已被初步证明具有生殖和发育毒性的增塑剂。该消息一经发布,消费者对这些产品的安全性产生了巨大质疑。塑料包装所含有的增塑剂是一种重要的污染源。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-2-ethylhexyl phthalate, DEHP)是邻苯二甲酸酯类增塑剂中的一种主要成分,在塑料中的含量可达40%-60%,很容易进入环境。近几十年来,我国农膜和塑料大棚的使用量和使用范围逐年递增。DEHP作为一种环境污染物,还可以在饮用水、地表水、地下水、空气、土壤和动植物体内检测到。研究表明,DEHP可对实验动物的生殖器官、血液、肾脏、肺脏、肝脏等多种器官造成损伤,尤其是孕妇和发育期儿童对DEHP的毒作用非常敏感。随着塑料薄膜的广泛应用以及大量城镇污水和垃圾被排放到农田,越来越多的DEHP被释放进入农田土壤,成为农田土壤中最常被检出的有机污染物,其含量有时甚至高达近20mg·kg-1(干土),高出土壤背景值几十倍。目前,土壤中DEHP的残留对植物体的影响受到普遍关注。已有研究表明,DEHP在植物的根、茎、叶中均有不同程度的残留,植物茎、叶和根系对DEHP的吸收累积存在明显差异。目前关于DEHP对植物的影响研究主要集中在DEHP在植物中的残留以及植物体中DEHP的检测,关于DEHP对植物体的遗传毒性和氧化损伤方面的报道尚不多见。本研究以松滋青皮豆为实验材料,通过检测DEHP处理后根尖微核率和幼苗茎、叶SOD、POD活性和MDA的变化,以及对蚕豆根尖细胞DNA多态性的影响,初步探讨了土壤中DEHP残留对植物的毒害作用。研究结果如下：1. DEHP导致蚕豆根尖细胞染色体畸变蚕豆根尖微核实验(Micronuclens test, MCN)技术,是Degrassi提出的一种用于环境致突变物的检测方法。微核形成有2种途径：一是由纺锤丝毒剂打断纺锤丝造成的整条染色体落后于核分裂周期,形成微核；二是诱变剂打断DNA分子形成DNA断片,该断片没有纺锤丝相连,无法随染色体分离过程被拉向两极,因而随机滞留在某一个子细胞的细胞质中形成独立于细胞外的微小的具有核形状的微核。由此可以推断,当蚕豆根尖细胞微核率上升时,被测试样品中含有能打断纺锤丝的纺锤丝毒剂或能打断DNA分子的诱变剂,从而表现出遗传毒性。结果表明,随着DEHP含量的升高,蚕豆根尖细胞微核率逐渐升高；各DEHP处理组细胞微核率与对照组相比,均有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。当DEHP含量为0.2～200mg·kg-1(细沙)时,其污染指数在2.18～4.94之间,随着DEHP浓度的升高,污染指数逐渐升高。2. DEHP导致蚕豆幼苗茎、叶的氧化损伤植物体内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是一类重要的抗氧化酶,参与植物的许多生理生化过程,在清除体内活性氧自由基的多酶复合体中,具有抗自由基的协同、联合作用作用,使细胞内的活性氧保持较低水平,可以作为检测环境污染物胁迫的生物标记物。另外,膜脂过氧化最终分解产物为丙二醛(MDA),其含量可以反映植物遭受外界胁迫因素的程度。本研究以蚕豆幼苗茎、叶为材料,研究不同浓度DEHP暴露下,抗氧化酶活性和丙二醛含量的变化,为进一步阐明DEHP对植物毒害的生理机制提供依据。结果表明,随DEHP浓度的升高,蚕豆幼苗茎、叶SOD和POD活性和MDA含量呈逐渐升高趋势,与对照组相比有显著性差异(p<0.05或p<0.01),但在高浓度200 mg-kg-1时,2种抗氧化酶活性开始下降。3. DEHP导致蚕豆根尖细胞基因组DNA多态性的变化随机扩增多态性DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)是利用PCR技术进行随机扩增,把扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳,根据DNA条带的多态性来反应模板DNA序列上的多态性。RAPD同AFLP、SSR等分子标记一样都基于PCR扩增,只是RAPD分析只需要一个引物,其引物长度一般为10个核甘酸,其序列是随机的,不同核甘酸序列的引物均有商品出售。结果表明,蚕豆幼苗根系生长的显著抑制作用与其RAPD图谱的变化之间具有很好的剂量—效应关系,说明幼苗根尖细胞中DNA的损伤程度比较严重,DEHP对基因组模板的稳定性也有较大的影响。蚕豆幼苗基因组DNA的RAPD谱带变化可能是由于基因组重排引起了寡核苷酸引发位点变化,或是由于DEHP胁迫诱导了生物体细胞内单链或双链DNA的断裂、插入或缺失片段、DNA加合物、DNA—-蛋白质交联甲基化等多种形式的DNA损伤,引起DNA构象的改变,形成了新的RAPD图谱。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
一、文献综述  10-19
  1. 邻苯二甲酸酯概况  10
  2. 邻苯二甲酸酯的分类  10
  3. 邻苯二甲酸酯的分布  10-13
    3.1 中国长江流域地下水中PAEs的分布  10-11
    3.2 中国电子产品回收地土壤中PAEs的分布情况  11-13
  4. 邻苯二甲酸酯的生物毒性  13
  5. 邻苯二甲酸酯的研究意义  13-14
  6. DEHP的理化性质  14
  7. DEHP的毒性作用  14-16
    7.1 医疗器材PVC中释放的DEHP使用风险  14-15
    7.2 DEHP免疫毒性  15-16
  8. DEHP在农作物中的残留  16
  9. 土壤中DEHP对植物的影响  16-18
    9.1 蚕豆根尖细胞微核试验  16
    9.2 抗氧化酶活性及丙二醛含量  16-17
    9.3 随机扩增多态性DNA的应用  17-18
  10. 立项依据  18-19
二、材料与方法  19-27
  1. 实验材料  19-21
    1.1 实验受试植物  19
    1.2 主要化学试剂  19
    1.3 微核实验所需试剂  19-20
    1.4 蚕豆培养所需营养液  20-21
    1.5 RAPD所需溶液  21
    1.6 主要实验仪器  21
  2. 染毒方法  21-22
    2.1 微核实验染毒  21
    2.2 检测抗氧化酶及丙二醛检测实验染毒  21
    2.3 DNA多态性检测染毒  21-22
  3. 实验方法  22-27
    3.1 蚕豆根尖微核实验  22-24
    3.2 蚕豆幼苗茎叶SOD、POD和MDA的检测  24
    3.3 蚕豆幼苗根尖基因组DNA的提取与RAPD图谱检测  24-26
    3.4 数据分析  26-27
三、实验结果  27-33
  1. DEHP致蚕豆根尖微核实验结果  27-28
  2. DEHP对蚕豆幼苗茎、叶SOD和POD活性的影响  28
  3. 不同浓度DEHP处理对蚕豆茎、叶MDA含量的影响  28-29
  4. DEHP对蚕豆幼苗生长和可溶性蛋白水平的影响  29-30
  5. DEHP胁迫对RAPD图谱的影响  30-33
四、讨论  33-38
  1. 蚕豆微核技术的选择  33
  2. DEHP致蚕豆根尖染色体畸变与微核实验结果讨论  33-34
  3. 蚕豆茎,叶SOD、POD、MDA的实验结果讨论  34-36
  4. RAPD技术的选择  36
  5. DEHP致蚕豆根尖RAPD多态性图谱实验结果讨论  36-38
五、结论  38-39
参考文献  39-47
主要英文缩写  47-48
附录  48-50
致谢  50

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对蚕豆幼苗发育的影响

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