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ITSN2-L与RABEP1的相互作用及功能研究

作　者: 贺志成
导　师: 张健；向双林
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ITSN RABEP1 泛素化 胞吞 囊泡转运
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


人ITSN (intersectin)蛋白是一类在胞浆中分布的连接蛋白(adaptor protein),在细胞的胞吞胞吐、信号转导、受体降解和细胞生存中起着重要作用。现在已发现两个ITSN同源蛋白——ITSN1和ITSN2, ITSN1和ITSN2又分别有一个短的和长的异构体ITSN1-S、ITSN2-S、ITSN1-L和ITSN2-L。ITSN-S广泛表达于人的各种组织和细胞,ITSN-L则主要在神经组织中表达。研究表明,ITSN能够参与胞吞胞吐作用,在神经元细胞中对维持神经递质的释放起重要作用,此外ITSN还参与细胞内信号传导通路的调节。本文用酵母双杂交的方法筛选得到10个与ITSN2-L的CC结构域相互作用的蛋白,我们选择了重复数最多的,克隆并表达了RABEP1基因,并证实了RABEP1蛋白与ITSN2-L能够在体外相互作用,而且免疫共沉淀的结果表明在HeLa细胞系中过表达的ITSN2-L与RABEP1蛋白能够处于同一复合体中,同时发现HeLa细胞系中,内源、外源表达的ITSN2-L蛋白与RABEP1有明显的共定位。结果表明这两种蛋白能相互作用,通过这样的结合完成复杂的调节功能。本文还对ITSN2-L与RABEP1蛋白的功能进行了初步探索,发现ITSN2-L过表达可以导致RABEP1蛋白通过蛋白酶体途径降解,而抑制ITSN2-L的表达时,RABEP1蛋白则有所升高；而且,ITSN2-L的过表达对RABEP1过表达所产生的巨大囊泡有抑制作用。这些结果说明,ITSN2-L是RABEP1的负调控蛋白,可以通过调控RABEP1蛋白量的变化,进而参与囊泡的转运过程。

全文目录


英文缩写表  3-4
摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
前言  8-16
  1 ITSN蛋白简介  8-11
    1.1 ITSN蛋白的结构  8-9
    1.2 ITSN蛋白的功能  9-11
  2 RABEP1蛋白简介  11-12
  3 网格蛋白有被小泡与转铁蛋白的内吞  12-14
    3.1 网格蛋白有被小泡(clathrin-coated vesicle)  12-13
    3.2 转铁蛋白(transferrin)受体介导的内吞  13-14
  4 泛素—蛋白酶体途径  14-16
    4.1 蛋白质泛素化系统  14-15
    4.2 蛋白酶体  15-16
第一部分 材料与方法  16-28
  1 材料  16-18
    1.1 菌种和细胞株  16
    1.2 载体、工具酶和si-RNA  16
    1.3 质粒  16-17
    1.4 抗体  17
    1.5 相关试剂  17
    1.6 所需溶液  17-18
  2 实验方法  18-28
    2.1 酵母双杂交实验  18-19
    2.2 GST pull-down实验验证ITSN2-L与RABEP1体外相互作用  19-21
    2.3 细胞培养  21-22
    2.4 免疫共沉淀实验验证ITSN2-L与RABEP1体内相互作用  22-23
    2.5 细胞免疫荧光实验  23-24
    2.6 RNA干扰实验  24-26
    2.7 转铁蛋白内吞实验  26-28
第二部分 结果与分析  28-41
  1 酵母双杂交筛选ITSN2-L的相互作用蛋白  28-29
  2 ITSN2-L与RABEP1蛋白的相互作用  29-35
    2.1 酵母双杂交验证ITSN2-L与RABEP1相互作用  29-30
    2.2 GST pull-down实验验证ITSN2-L与RABEP1体外相互作用  30-32
    2.3 免疫共沉淀实验验证ITSN2-L与RABEP1体内相互作用  32-34
    2.4 细胞免疫荧光实验验ITSN2-L与RABEP1在细胞内共定位  34-35
  3 过表达ITSN2-L促进RABEP1蛋白降解  35-38
    3.1 过表达ITSN2-L促进RABEP1蛋白降解  35-37
    3.2 干扰ITSN2-L蛋白的表达抑制RABEP1蛋白降解  37-38
  4 ITSN2-L与RABEP1蛋白影响转铁蛋白的内吞  38-41
第三部分 讨论  41-45
参考文献  45-48
致谢  48-49

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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