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副血链球菌粘附素Fap1糖基化相关基因-nss的功能研究

作　者: 朱凡
导　师: 周梅先
学　校: 河南科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: Fap1 粘附素 糖基化 副血链球菌
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:成熟的糖蛋白Fap1是一个副血链球菌细胞表面粘附素,对人类最复杂的生物膜牙菌斑形成非常重要。Fap1糖基化由fap1基因座附近的基因簇所调控。已有研究表明位于fap1基因座下游的Gtf1和Gtf2参与Fap1第一步糖基化,可将N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)转移至Fap1肽段上。但对于Fap1糖基化的后续步骤是如何进行这一问题至今还是未知。本研究针对位于fap1基因座上游的nss基因在Fap1糖基化中的功能进行了探求。方法:(1)构建nss基因突变株及回复突变株:采用基因置换技术以野生型Streptococcus parasanguinis FW213菌株为出发菌株构建nss基因突变株;并采用基因互补技术(将nss基因克隆入大肠杆菌和副血链球菌穿梭表达载体中,并转化nss基因阻断突变株)对突变株进行基因互补;运用Western Blotting和BactELISA检测nss基因突变株、回复突变株与副血链球菌野生型菌株的表型,即Fap1蛋白的糖基化情况。(2)在异源宿主大肠杆菌系统中鉴定与Fap1糖基化相关基因nss的功能:构建一系列含有不同拟糖基转移酶基因的重组质粒,将这些重组质粒分别与含有Fap1△RII(缺失RII重复区的Fap1蛋白)的重组质粒以及含有Gtf1和Gtf2的重组质粒共转化到大肠杆菌中,运用Western Blotting检测在不同的基因存在的情况下Fap1△RII蛋白的糖基化情况。(3)利用气相色谱质谱分析法确定nss基因的特性:从大肠杆菌中纯化带有nss的重组蛋白rFap1 (+Nss)和不含nss的重组蛋白rFap1 (-Nss);然后利用气相色谱质谱分析法检测Fap1△RII蛋白的单糖组分。结果:(1)nss基因突变株不能与抗Fapl多糖表位的特异性抗体F51和D10反应,但nss基因的回复突变株可以恢复野生型副血链球菌FW213的表达,均可于特异性抗体F51、E42、D10反应。(2)只有在加入Nss后,经Gtf1和Gtf2修饰的Fap1在凝胶中的迁移速度变慢,而其他拟糖基转移酶的加入并没有使Fap1在凝胶中的迁移速度发生变化。(3)被Gtf1、Gtf2和Nss共同修饰的重组Fap1蛋白出现了两个峰值,分别为N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和葡萄糖(Glucose),而在缺失Nss,只有Gtf1、Gtf2修饰的重组Fap1蛋白中只出现一个峰值,即N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)。结论:Nss参与并调控Fap1糖基化的第二步;Nss是一个葡萄糖基转移酶。

全文目录


摘要  2-4
ABSTRACT  4-7
第1章 前言  7-12
  1.1 口腔链球菌  7
  1.2 粘附素及生物膜的形成  7-8
  1.3 粘附素Fap1 及其糖基化的研究  8-12
第2章 材料与方法  12-22
  2.1 菌株，引物与质粒  12-14
  2.2 主要试剂  14-15
  2.3 副血链球菌nss 基因置换突变株的构建  15-19
    2.3.1 nss 基因的TA 克隆  15-17
    2.3.2 反向PCR 与自身连接  17-18
    2.3.3 卡那霉素基因盒aphA-3 克隆到pAL13  18
    2.3.4 Δnss-aphA3 基因片段克隆到pSF143  18
    2.3.5 副血链球菌nss 基因置换突变株的获得  18-19
  2.4 副血链球菌nss 基因置换突变株的互补分析  19
  2.5 Western Blotting 检测副血链球菌中Fap1 的表达  19-20
  2.6 不同拟糖基转移酶在Fap1△RII 中的共表达  20
  2.7 大肠杆菌中Fap1△RII 糖基化的检测  20
  2.8 Fap1 重组蛋白糖组分的GC-MS 分析  20-22
第3章 结果  22-26
  3.1 nss 基因参与并影响Fap1 的糖基化  22-23
  3.2 Nss 参与Fap1 糖基化过程中的第二步  23-24
  3.3 Nss 是一个葡萄糖基转移酶  24-26
第4章 讨论  26-28
参考文献  28-33
致谢  33-35
攻读硕士学位期间的研究成果  35

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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