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大鼠热适应相关基因消减文库的构建和差异表达基因的分离、鉴定及序列分析

作　者: 肖军
导　师: 邹飞
学　校: 第一军医大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 热适应抑制性消减杂交（SSH）大鼠基因热休克蛋白（HSP） p53蛋白
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

人体在高温环境下适应和耐受能力的研究历来受到国内外关注。它决定了人类与环境交互作用的过程中能否有效地适应高温环境，维持生存。从军事特殊环境医学的角度看，更要求在高温野战条件下保持战斗力。因此，研究热适应现象，探索促进机体热适应能力提高的有效途径，对于提高高温战区指战员工作和战斗效率，减少中暑引起的非战斗减员，具有重要的意义。探索提高热适应能力的有效途径，必须建立在阐明热适应分子机理的基础上。研究表明，热适应是一个受多因素调控的复杂过程，仅根据目前的研究资料还不足以明确解释热适应现象。因此，全面分离参与热适应的生物活性物质，揭示这些生物活性物质发挥功能的途径，对于系统研究热适应分子机理尤为重要。目的：采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSll）技术，探讨热适应人鼠肝脏组织基囚的差异表达，力求在坯凶水平阐明热适应的本质。方法：将封 6J群同胞、雄性 SD大鼠（n＝6）平均分为热适应组（n二3）。和常温对照组＊4人利用数字化仿真气候室制备热适应动物模型。分别提取肝脏组织mRNA，采用SSH技术反转录dNA，酶切、接头连接后依次以热适应组和常温对照组cDNA作为tester，另一组cDNA作为driver进行连续两次消减杂交。巢式PCR产物连接T载体，转化宿主菌。扩增目的基因，采用 Differential Screening和 t，ev。rse Northern Blot技术进行筛选鉴定。阳性差异表达基因送交测序，结果提交GetleB。uk进行同源性对比分析。结果：热适应组模型动物获得了充分的热适应。从参比两组大鼠肝脏组织分别提纯了高质量的总RNA和mRNA，完整反转录为双链cDNA，Rsal彻底酶切，获得了长度均一性较好的短片段。高效连接特定接头，经过连续2轮消减杂交，构建了上调、下调表达2个热适应相关基因消减CDNA文库，经检测消减效率较高。巢式PCR扩增特异性高，使差异表达基因得到了指数扩增。产物连接 T载体并成功转化 TOP OF’大肠杆菌感受态细胞，侄文库中的差异表达基因得到分离。从上调表达消减文库中初步分离出 200个目的基因片段，经 Differential Screening和，everse Northern Blot技术筛选鉴定，确认其中25个基因为阳性差异表达基因。测序结果提交GeneBank进行同源性对比分析，确定差导表达基因的编码蛋白，以及确认新基因。结论：①首次将抑制性消减杂交技术（SSH）应用于热环境医学领域的研究，从基因差异表达的角度，系统研究热适应现象的分子机理。＠构建了热适应相关基因上调、下调表达 CDNA消减文库，为进一步分离热适应差异表达基因奠定了基础。③不同于以往文献从离体培养细胞水平报道HSP参与热耐受，本实验从基因差异表达的角度，在整体动物水平发现了热适应动物肝脏组织中也存在着HSP27、HSP86和“肿瘤抑制蛋白”一p53蛋白编码基因的上调表达，间接证实了热适应机体中存在HSP27、HSP86和p53蛋白的基础表达升高现象，说明HSP27、HSP86和 p53参与了热适应分子机制。④发现了 10个在热适应过程中表达上调的新基因EST，己经全部被GeneBank收录，登陆序列号：BM285377、－4－ BM378053－62。通过在此基础上扩增全长基因，可以表达新的蛋白质，对深入研究热适应现象具有重要的价值。⑤采用地高辛标记PCR探针替代了传统 Differential Screening技术的同位素 P‘二dCTP探针，在继承其高灵敏度和良好特异性的基础上避免了放射性污染，简化了实验操作。

全文目录

中英文缩略词对照表  4-5
摘要  5-11
前言  11-20
第一部分  20-34
  材料与方法  20-25
  结果  25-31
  讨论  31-34
第二部分  34-55
  材料与方法  34-43
  结果  43-51
  讨论  51-55
第三部分  55-96
  材料与方法  55-64
  结果  64-90
  讨论  90-96
结论  96-98
参考文献  98-102
致谢  102-103
综述  103-108

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