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聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核苷酸载体的研究

作　者: 王文喜
导　师: 梁文权
学　校: 浙江大学
专　业: 药剂学
关键词: 反义寡核苷酸 纳米粒 阳离子纳米粒 长循环纳米粒 聚甲基丙烯酸酯 药物传递 基因载体 基因传递 表面修饰
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


反义寡核苷酸（ODN）是通过Waston-Crick氢键或Hoogsteen氢键与特定的mRNA或DNA发生特异性结合，从而抑制或封闭基因的表达，使其丧失活性，达到基因控制和基因治疗的目的。然而其为亲水性的聚阴离子，生物膜的通透性差，在体液中易受核酸酶的降解，使其应用受到了广泛的限制。为了增加细胞的摄入率和稳定性，而不降低专一性，许多研究者采用了各种载体用以传递ODN。其中阳离子纳米粒因具有高效、低毒、稳定等优点受到了普遍的重视。本研究采用阳离子聚合物Eudragit?RL100和RS100制备纳米粒用于传递ODN，旨在提高进入细胞内的ODN量，增加ODN对核酸酶的稳定性，改变ODN的细胞内分布，使其避免溶酶体的降解。 本研究采用了溶剂-非溶剂法制备纳米粒，即在Eudragit?RL100或RS100的乙醇溶液中缓慢加入水，使材料以纳米大小的颗粒析出，挥去乙醇即得空白纳米粒，在空白纳米粒中缓慢加入寡核苷酸溶液，涡流振荡10min即得载药纳米粒。用电子显微镜观察得纳米粒的形态规整、几乎呈球型，用激光衍射粒度分析仪测得纳米粒的粒径分布良好，RL-NP和RS-NP的Z平均粒径分别为127.0nm和231.2nm，随着寡核苷酸量的不同，载药纳米粒的平均粒径和粒径分布有所变化。 超滤法测得Eudragite? RL100纳米粒对ODN的吸附率很高，当ODN和RL100的质量比为1：6.6时，几乎全部被吸附，氯化钠和磷酸缓冲液等低分子电解质对ODN的吸附没有影响，血清使ODN的吸附有所下降，30％的血清使吸附率下降7.2％，而高分子量的肝素使得ODN的吸附下降13％。 浙江大学硕士学位论文·聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核昔酸载体的研究 稳定性考察表明Eudragit＠ RL100和RS100纳米粒的稳定性良好，能耐受高 压湿热灭菌，室温放置3个月后RL100纳米粒无明显变化，RS100纳米粒仅有少量 的沉淀，但用力振摇后，还能均匀分散，超声smin后，显微镜下观察纳米粒的 粒径如先。但是，本纳米粒对电解质，培养基以及血清的稳定性较差，在它们 的作用下纳米粒发生了明显的聚集。 体外释药试验表明Eudragit＠ RL100纳米粒的体外释药较为缓慢，释放90％二 的ODN需要sd左右，释药方程与立方根方程和平方根方程拟合最佳，相关系数分k”“—一”‘“”——“”””—“”“’—“——””’””””’一”””’””””’—”—”一 一’一”—”””””—”””” 别为0．9943和0．9937，释药初始阶段有明显的突释现象。 体外细胞培养试验表明，游离的ODN与细胞共同孵育sh后，仅有极少部分的 ODN进入细胞，使用纳米粒后进入细胞内的ODN显著增加，纳米粒的浓度越高， 增加越多。当Eudragit＠RL100和RS100的浓度为20Pg砌l时，M。骨髓瘤细胞内的 ODN量分别增加456倍和395倍，进入WIC细胞内的ODN量分别增加683倍和520倍。 载药纳米粒进入细胞的行为具有能量依赖性，在4 oC条件下仅有极少部分的ODN 进入细胞，而在37℃时，细胞内的ODN显著增加，说明载药纳米粒主要是通过内 吞途径进入细胞的。纳米粒的这种促进ODN进入细胞的作用受到培养液中血清的 影响，在血清存在下，进人细胞内的ODN急剧下降，加入 10％的血清，使得进入 细胞内的ODN下降 10倍，30％血清细胞内的ODN仅为无血清培养的4．6％。本实验还 在培养基中加入氯喳，考察氯喳对细胞内荧光总强度的影响，结果发现氯哇对 细胞内的荧光没有明显的影响，说明纳米粒不存在于溶酶体内，因此，载药纳Z 米粒能改变ODN在细胞内的分布，避免ODN被溶酶体内核酸酶的降解，增加ODN ～的稳定性。 为了使纳米粒逃脱网状内皮系统的清除，增加纳米粒在体循环中的停留时 间，本实验采用Tween 20、Tween 80、Poloxamey、PEG 6000、PEG400、Brij 78 对纳米粒进行了表面修饰，测定这些修饰对纳米粒表面疏水性和蛋臼吸附的影 响，并测定了小鼠腹腔巨噬细胞对修饰后的纳米粒的摄入，结果发现Tween 20、 Tween SO． Poloxamev、PEG 6000、PEG 400等都降低 了纳米粒的疏水性，所有 的修饰都能降低纳米粒的蛋白吸附，并且大大降低了小鼠腹腔巨噬细胞对纳米 2 浙江大学硕士学位论文·聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核昔酸载体的研究 粒的吞噬。

全文目录


中文摘要  3-6
英文摘要  6-9
前言  9-11
实验内容  11-47
  一、 纳米粒的制备和性质  11-28
  二、 体外细胞培养  28-40
  三、 纳米粒的表面修饰  40-47
结论  47
参考文献  47-52
综述  52-79
致谢  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学
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