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伊维菌素的抗体制备及ELISA法残留分析

作　者: 张梅
导　师: 张继瑜
学　校: 中国农业科学院
专　业: 基础兽医学
关键词: 伊维菌素(IVM) 阿维菌素类(AVMs) 聚-L-赖氨酸(PLL) 残留分析 酶联免疫(ELISA)
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


伊维菌素（Ivermectin,ⅣM）属于大环内酯类抗生素,由于其优良的驱虫活性而广泛应用于畜牧业。然而作为高毒性化合物和在动物体内的长效特性,ⅣM在动物组织中的残留不容忽视。本研究旨在制备和筛选针对ⅣM的多克窿抗体,并以此抗体为核心试剂建立检测动物组织中ⅣM残留的ELISA快速检测方法。 本研究将伊维菌素（Ivermectin,ⅣM）制备成半抗原4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM和5-O-（单）琥珀酰ⅣM,质谱鉴定其分子量为976和976.3,与目标产物分子量一致。将半抗原4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM与载体蛋白BSA和PLL偶联,制备了免疫抗原4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-BSA和4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-PLL;将半抗原5-O-（单）琥珀酰ⅣM和PLL偶联,制备了又一免疫抗原5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL。半抗原5-O-（单）琥珀酰ⅣM与载体蛋白OVA偶联,制备了包被抗原5-O-（单）琥珀酰ⅣM-OVA。在免疫抗原5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL的制备中,采用正交试验设计对该合成的反应条件进行选择,结果为在Ph8.5,PLL35mg,4℃,8小时时收率52.6%和偶联比为30.2,为最佳结果。免疫抗原与包被抗原经SDS-PAGE电泳鉴定,载体蛋白与半抗原的结合比1:14.5～1:30.2。 以4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-BSA、4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-PLL和5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL作为免疫抗原免疫新西兰白兔,经过5次免疫后,三抗血清的效价可达1:105。通过非竞争抑制试验对血清效价测定结果及抗体纯化后的Western blot结果,可以看出以4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-PLL和5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL作为免疫抗原制备得到的抗体,在免疫原性和对ⅣM的特异性上,无明显差异。因5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL较4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-PLL的合成过程大大简化,在以后建立的ELISA检测方法中,以抗4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-BSA抗体和抗5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL抗体为基础建立ELISA竞争性抑制试验。通过方阵法确定包被抗原、抗体的最适工作浓度,结果表明包被抗原的包被浓度为30μg/ml,两抗体的稀释倍数均为1;105,酶标二抗的工作浓度为1:1000。通过正交试验优化选择ELISA检测ⅣM残留的竞争反应条件,结果表明pH值（6.4～8.4）、离子强度（0.05～1.5M NaCL）和甲醇浓度（5～15%（v/v））对两种抗体的ELISA竞争反应均无明显影响,两种抗体建立的ELISA竞争反应中均以pH值7.4、离子强度0.50M（NaCL）和10%甲醇为基础反应条件。 研究中同时建立的三种抗体在选择同一个包被原和不同包被原时,共四个试验组合,来进行ⅣM的ELISA残留分析时的标准曲线,并比较了四组合在残留检测最低限和灵敏性的不同。对四个曲线分析结果为所设计的四个试验在用于ⅣM的残留检测时,均能满足ⅣM残留检测要求,其中检测限最低的为0.83ng/g,IC50最高的为7.01ng/g。对曲线的分析结果看出,以PLL做ⅣM的免疫增强载体时优于BSA。 研究中采用的ELISA方法检测动物四种组织（肌肉、肝脏、血浆和牛奶）中的ⅣM,设计两个不同抗体和包被原组合方案,进行了同收率的确定。两个试验中（第四章试验5）对动物组织中添加ⅣM检测回收率在93.9%～101.2之间,变异系数不超过5.1%,（第四章试验6）对动物组织中添加ⅣM检测回收率在92.6%～101.7%之间,变异系数不超过6.3%,均为比较理想的结果。 研究结果表明,以抗4″-O-（单）-琥珀酰ⅣM-BSA抗体和抗5-O-（单）琥珀酰ⅣM-PLL抗体为

全文目录


前言  11-13
文献综述  13-21
  1 伊维菌素(IVM)药理学和毒理学研究概况  13-16
    1.1 IVM药理学研究  13-14
    1.2 IVM毒理学研究  14-16
  2 兽药ELISA残留分析研究进展  16-21
    2.1 人工抗原合成的研究  17-19
    2.2 人工抗原的鉴定  19
    2.3 建立残留检测的ELISA方法研究进展  19-21
第一章 伊维菌素半抗原的合成  21-28
  1.1 材料与方法  21-23
    1.1.1 材料  21
    1.1.2 试验设计  21-23
  1.2、结果与分析  23-24
    1.2.1 半抗原4″-O-(单)-琥珀酰IVM的合成与鉴定  23-24
    1.2.2 半抗原5-O-(单)琥珀酰IVM的合成与鉴定  24
  1.3、小结与讨论  24-28
第二章 伊维菌素人工完全抗原的合成与载体优化研究  28-35
  2.1 材料与方法  28-30
    2.1.1 材料  28-29
    2.1.2 抗原合成、纯化与鉴定  29-30
  2.2 结果与分析  30-34
    2.2.1 免疫抗原4″-O-(单)-琥珀酰IVM-BSA的合成、纯化与鉴定  30-31
    2.2.2 免疫抗原4″-O-(单)-琥珀酰IVM-PLL的合成、纯化与鉴定  31-32
    2.2.3 免疫抗原5-O-(单)琥珀酰IVM-PLL的合成、纯化与鉴定  32
    2.2.4 包被原5-O-(单)琥珀酰IVM-OVA的合成、纯化与鉴定  32-34
  2.3. 小结与讨论  34-35
第三章 伊维菌素多克隆抗体制备  35-45
  3.1 试验材料与试剂  35-37
    3.1.1 药品  35
    3.1.2 实验动物  35
    3.1.3 主要仪器  35
    3.1.4 主要试剂  35-36
    3.1.5 ELISA主要溶液  36
    3.1.6 SDS-PAGE电泳  36
    3.1.7 转移电泳和斑点免疫  36-37
  3.2 试验方法  37-40
    3.2.1 免疫动物的准备及免疫程序  37
    3.2.2 非竞争ELISA方法的建立  37-38
    3.2.3 抗血清效价测定  38-39
    3.2.4 抗体的纯化  39
    3.2.5 抗体纯度和特异性鉴定  39-40
  3.3 结果与分析  40-43
    3.3.1 包被原工作浓度和抗血清工作浓度确定  40-42
    3.3.2 抗血清效价测定  42
    3.3.3 抗体的纯化  42-43
  3.4 小结与讨论  43-45
第四章 竞争ELISA反应条件的建立  45-51
  4.1 材料与方法  45-47
    4.1.1 药品与主要试剂  45
    4.1.2 试验器材  45
    4.1.3 试验方法设计  45-47
  4.2 结果与分析  47-50
    4.2.1 标准曲线的建立  47-48
    4.2.2 样本添加标准曲线和回收率的测定  48-50
  4.3 小结与讨论  50-51
第五章 结论  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
作者简介  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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