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不同部位取材的雪旺细胞培养、纯化及其与丝素蛋白纳米纤维材料的相容性研究

作　者: 王世清
导　师: 沈忆新
学　校: 苏州大学
专　业: 骨外科学
关键词: 雪旺细胞背根神经节生物相容性纳米纤维丝素蛋白
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:建立能够获得高活性、高纯度和足够数量雪旺细胞(schwann cells,SCs)的培养方法,为周围神经缺损的修复提供优质、足量的种子细胞。寻找支持SCs的粘附、生长的材料,提供可引导其生长和具有良好生物相容性的三维生物支架。方法:1.选用6只5 d龄SD大鼠,切取背根神经节(实验组)和坐骨神经(对照组)。采用联合酶消化加机械吹打法分离培养SCs,并进行纯化及传代培养。取第1代SCs,用计数法绘制培养8 d内SCs生长曲线,MTT法检测8 d内SCs增殖情况,抗S-100免疫细胞化学法检测SCs纯度,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)浓度。2.采用静电纺丝技术制备1000 nm直径的丝素蛋白纳米纤维。3.将从新生SD大鼠背根神经节分离的SCs经改良差速贴壁纯化培养后,取第1代细胞分别接种至培养皿中,盖玻片分别以左旋多聚赖氨酸(PLL组)、丝素蛋白纳米纤维1000 nm组(TSF组)包被,复合培养不同时间点行倒置相差显微镜观察细胞形态、生长及与材料黏附情况,抗S-100免疫荧光染色鉴定两组SCs并计算其纯度,MTT法测定2组SCs的增殖情况并行材料毒性评价,ELISA法检测2组细胞分泌BDNF浓度。结果:1.每只大鼠可切取背根神经节36～43个。消化成单个细胞后计数,实验组可提取(7.5±0.6)×10~6个SCs,高于对照组(3.5±0.4)×10~6个SCs,差异有统计学意义(P<0.05)。SCs第3 d开始进入对数增殖期,随培养时间延长,两组细胞数量及增殖吸光度(A)值均呈上升趋势;培养3、4、5、6 d,实验组细胞数及A值明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。经S-100免疫细胞化学法检测,实验组SCs纯度为92.08%±3.45%,对照组为77.50%±3.57%,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA法检测示实验组培养3 d和5 d的BDNF浓度均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.倒置相差显微镜示丝素蛋白纳米纤维上培养的SCs与对照组相比,细胞沿丝素纤维分布,细胞突起方向与丝素蛋白走向较一致,形态特征无显著差异。培养3 d时,S-100免疫荧光染色示PLL组SCs纯度为91.25%±2.57%,TSF组为91.51%±1.34%(P>0.05);SCs在丝素蛋白纳米纤维上仍保留其特有的表现型,TSF组轴突长度及复杂度均高于PLL组。MTT检测示培养1、3、5、7、9 d两组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养1、3、5、7、9 d,细胞相对增殖率均大于90%,根据GB/T 16886标准,细胞毒性为1级,无毒。ELISA法检测示培养3 d和5 d两组SCs分泌的BDNF浓度水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:取材于背根神经节能获得数量更多、纯度和活性更高的SCs,能满足周围神经修复研究的需要。柞蚕丝素蛋白纳米三维多孔支架生物相容性良好,安全无毒,有望成为修复周围神经损伤的组织工程支架材料。

不同部位取材的雪旺细胞培养、纯化及其与丝素蛋白纳米纤维材料的相容性研究

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