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流体剪应力作用下成骨细胞的响应及其OPG、ODF表达的研究

作　者: 张兵兵
导　师: 潘君；王远亮
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 剪应力 成骨细胞 破骨细胞 增殖 分化 矿化 骨保护因子 破骨细胞分化因子
分类号: R318.01
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


本研究以Wistar 大鼠颅骨成骨细胞为研究对象,通过流动腔装置施以流体剪应力,从细胞的增殖、分化、矿化和形变研究成骨细胞对流体剪应力的响应,从骨保护因子(OPG),破骨细胞分化因子(ODF)的基因表达研究力学刺激对骨吸收和骨形成平衡的调控,最后尝试成骨细胞对破骨细胞形成的诱导作用,进一步考察了力学刺激影响骨代谢平衡的可能途径。主要内容和结果如下: 设计加工了对单层细胞施以流体剪应力的流动腔装置。该装置能够提供充分发散的层流态流体,通过流量控制调节剪应力的大小。整套装置组装简便,受试细胞量大(1×10~5个),所需灌流液可控制在10ml 以内,能够对细胞进行有效的剪应力刺激,研究表明能满足对各项生化指标的检测。运用组织块法培养了大鼠乳鼠颅骨成骨细胞,并利用差异贴壁法对其进行有效纯化。通过形态观察、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、Von Kossa 染色鉴定表明具有成骨细胞的典型生物学行为。细胞经过传代培养至第三代用于后续力学实验。对成骨细胞施加5、10、20、30 dynes/cm~2四个水平的流体剪应力,每个水平的力分别作用3,6,12,24,36h。加载结束,受试细胞做流式细胞仪检测细胞周期,计算增殖指数(proliferation index,PI)衡量细胞增殖能力的变化。细胞形态变化通过显微镜形态观察和FITC-鬼笔环肽(FITC-phalloidin)细胞骨架荧光染色来观察。结果显示,5,10 dynes/cm~2的剪应力具有促进细胞增殖的作用,作用12h 细胞的增殖指数分别提高了20.2%和45.7%,并且细胞形态沿流体流动的方向被拉长,细胞骨架荧光染色显示,骨架发生重排。本实验中20,30 dynes/cm~2的剪应力抑制了细胞的增殖,作用12h,分别降低了72.6%和76.3%。对成骨细胞施加5、10、20、30 dynes/cm~2四个水平的流体剪应力,每个水平的力分别作用3,6,12,24,36h。检测成骨细胞ALP 活性和胞外钙分泌的变化。结果显示,剪应力作用下ALP 的活性从高到低依次是10>20>5>0>30 dynes/cm2,同时10,20 dynes/cm2在提高ALP 活性的同时,还使ALP 活性高峰期相对于对照组提前3h。剪应力作用下钙分泌从高到低依次是10>5>20>0>30 dynes/cm~2,钙分泌的时间分布未受影响,只是分泌量受到调节。由此认为,适当的剪应力(如5~20 dynes/cm2)作用能够促进成骨细胞的分化成熟,以及矿化基质的形成。对成骨细胞施以5、10、15 dynes/cm~2单一水平的流体剪应力作用24h,以及5、10、15 dynes/cm~2梯度增加和15、10、5 dynes/cm~2梯度减少的剪应力,梯度时间间隔为8 小时,总作用时间作用为24h,采用RT-PCR 检测成骨细胞OPG、ODF mRNA的表达状况。结果显示,OPG 和ODF mRNA 的表达均能受到剪应力作用的影响。与静态相比,10 dynes/cm2剪应力作用能促进OPG mRNA 的表达,抑制了静态下表达逐步降低的趋势,同时显著抑制了ODF mRNA 的表达,并且抑制作用随作用时间的延长逐步加强。比较相同时间下(24h)不同水平的剪应力作用,以及单一加载和梯度加载的效果发现,10、15 dynes/cm2作用效果最为明显,5 dynes/cm2次之。梯度增加的加载方式与10、15 dynes/cm2单一加载方式没有显著差异,梯度减少的加载方式与5 dynes/cm2单一加载也没有显著差异,因此认为梯度加载的过程中后一水平的剪应力作用掩盖了前一水平的剪应力作用效果,也可以认为剪应力的作用提高了成骨细胞对剪应力响应的速度,即同一水平的剪应力在梯度加载下加载8h 的效果与单一加载24h 的效果相当。总之剪应力作用使得OPG/ODF mRNA 的平衡向着OPG 占优的方向变化,这种变化意味着骨吸收会受到抑制。以骨髓单核细胞作为破骨细胞前体细胞,尝试剪应力作用下成骨细胞诱导破骨细胞生成。结果显示,以成骨细胞条件培养液培养骨髓单核细胞能明显提高细胞的存活率,改善生长状态。实验中形成的多核细胞的数量反映,剪应力作用下的成骨细胞诱导细胞融合的效果不如静态培养下的成骨细胞,说明力学刺激下成骨细胞诱导破骨细胞形成的作用受到抑制,这种抑制可能与力学刺激下骨代谢平衡的变化有关。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-12
1 绪论  12-19
  1.1 流体剪应力对成骨细胞的作用研究概述  12-14
    1.1.1 腔隙-小管网络结构  12
    1.1.2 流体剪应力能够对骨细胞产生有效刺激  12-14
  1.2 骨保护因子和破骨细胞分化因子  14-16
    1.2.1 骨保护因子  14-15
    1.2.2 破骨细胞分化因子  15-16
  1.3 问题的提出  16-17
  1.4 本研究的目的和内容  17-18
    1.4.1 研究目的  17
    1.4.2 研究内容  17-18
  1.5 本研究的创新点  18-19
2 流动腔装置的设计加工  19-24
  2.1 引言  19
  2.2 流动腔装置设计和加工  19-21
    2.2.1 设计思路  19
    2.2.2 结构和组成  19-21
  2.3 流室的参数估算  21
    2.3.1 流室底面切应力估算公式  21
    2.3.2 流动雷诺数估算  21
    2.3.3 入口长度估算  21
  2.4 结果与讨论  21-23
  2.5 实验小节  23-24
3 大鼠颅骨成骨细胞培养及其鉴定  24-29
  3.1 引言  24
  3.2 实验材料  24
    3.2.1 实验动物  24
    3.2.2 实验试剂和主要实验仪器  24
  3.3 实验方法  24-26
    3.3.1 原代细胞培养方法  24-25
    3.3.2 传代培养及纯化  25
    3.3.3 ALP 活性比较  25
    3.3.4 Von Kossa 法染色鉴定  25
    3.3.5 数据分析  25-26
  3.4 结果  26-27
    3.4.1 原代培养和传代培养细胞形态观察  26-27
    3.4.2 ALP 活性比较  27
    3.4.3 Von Kossa 法染色鉴定  27
  3.5 讨论  27-28
  3.6 实验小结  28-29
4 流体剪应力对成骨细胞生长行为的影响  29-36
  4.1 引言  29
  4.2 实验试剂和主要实验仪器  29
  4.3 实验方法  29-30
    4.3.1 细胞培养  29-30
    4.3.2 细胞加力  30
    4.3.3 细胞形态观察  30
    4.3.4 细胞骨架的荧光染色  30
    4.3.5 细胞分裂增殖能力的检测  30
    4.3.6 数据分析  30
  4.4 实验结果  30-33
    4.4.1 形态变化  30-32
    4.4.2 细胞骨架的改变  32
    4.4.3 细胞增殖指数的变化  32-33
  4.5 讨论  33-34
  4.6 实验小结  34-36
5 流体剪应力对成骨细胞分化和矿化的影响  36-43
  5.1 引言  36
  5.2 实验方法和步骤  36-37
    5.2.1 成骨细胞的培养  36
    5.2.2 剪应力实验  36
    5.2.3 碱性磷酸酶活性的测定  36-37
    5.2.4 胞外钙的测定  37
    5.2.5 数据分析  37
  5.3 实验结果  37-40
    5.3.1 静止状态下ALP 和钙分泌随时间的变化  37-38
    5.3.2 ALP 活性的变化  38-39
    5.3.3 胞外钙分泌的变化  39-40
  5.4 讨论  40-42
  5.5 实验小结  42-43
6 流体剪应力对成骨细胞 OPG 和 ODF 表达的影响  43-54
  6.1 引言  43
  6.2 材料和方法  43-46
    6.2.1 细胞培养  43
    6.2.2 对成骨细胞施加剪应力作用  43
    6.2.3 总RNA 提取  43-44
    6.2.4 反转录合成单链cDNA  44
    6.2.5 PCR 扩增  44-45
    6.2.6 RT-PCR 产物的分析  45-46
    6.2.7 数据分析  46
  6.3 实验结果  46-50
    6.3.1 RT-PCR 扩增条件及其循环数的确定  46
    6.3.2 剪应力作用对OPG、ODF mRNA 表达的影响  46-50
  6.4 讨论  50-53
  6.5 实验小结  53-54
7 剪应力作用下成骨细胞对破骨细胞形成的诱导实验  54-59
  7.1 引言  54
  7.2 材料和方法  54-55
    7.2.1 成骨细胞培养  54
    7.2.2 全骨髓细胞的获取和培养  54
    7.2.3 成骨细胞加力及对破骨细胞的诱导  54-55
    7.2.4 破骨细胞的鉴定  55
    7.2.5 数据分析  55
  7.3 结果  55-56
    7.3.1 骨髓细胞的培养  55
    7.3.2 细胞融合比较  55-56
  7.4 讨论  56-58
  7.5 实验小节  58-59
8 结论及后续工作建议  59-61
  8.1 主要结论  59-60
  8.2 后续工作建议  60-61
致谢  61-62
参考文献  62-68
附录 1  68-69
附录 2  69-70
独创性声明  70
学位论文版权使用授权书  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物力学
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