学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

海洋产几丁质酶菌株的筛选、鉴定与发酵工艺的优化

作　者: 潘志强
导　师: 鲍时翔
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胶体几丁质几丁质酶菌株筛选菌株鉴定 165rDNA 优化动力学模型
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 291次
引　用: 4次
阅　读: 论文下载

内容摘要

通过先富集培养、再用透明圈筛选的方法（以白色不透明胶体几丁质为底物）,从南海海域采集的海虾、海蟹、海葵、海兔、海鞘、海绵及海泥等样品中,分离到38株产几丁质酶的菌株,其中32株细菌、5株放线菌和1株真菌。然后,对所筛菌株的液体发酵产酶能力运用DNS法（3,5-二硝基水杨酸法）进行了测试,其结果与在固体培养基中的产酶能力基本一致。并采用了甘油速冻法对菌株进行了保藏。本研究选取了其中3株产酶能力较强的菌株,即0303、0318和0319分别进行了鉴定。首先,提取了其基因组DNA,利用16S rDNA两端特异保守性序列作为引物,对其16S rDNA序列进行了PCR扩增、回收、纯化、转化、鉴定和测序等,从而获得其16S rDNA序列。再将所得16S rDNA序列与GeneBank数据库中已收录真细菌16S rDNA序列作BLAST分析,结果得到了与其16S rDNA序列间相似性较高序列的分布;结合菌株形态及生理生化特征的分析与比较,鉴定出0303、0318和0319分别属于埃希氏菌属（Escherichia）、土壤杆菌属（Agrobacterium）和微球菌属（Micrococcus）。最后,在上述BLAST分析所得相似性序列中,选取一定量菌株16S rDNA序列,运用www.ebi.ac.uk生物信息网站的CLUSTALW在线分析软件,分别构建了它们的系统发育进化树。在所鉴定的三株菌中,0318菌株具有在海水和淡水胶体几丁质平板上产酶能力差异较大的特点,所以将0318菌株作为发酵产酶的供试菌株。通过对0318发酵工艺的研究,确定了其最佳产酶条件为:20%（v/v）胶体几丁质（w/v）、0.07%K₂HPO₄、0.04%KH₂PO₄、0.05%MgSO₄·7H₂O、0.001%FeSO₄·7H₂O、0.3%蛋白胨-NaNO₃（1:1）、2.0%NaCl是最佳培养基配比;接种量5%、接种72h种子液、发酵初始酸碱度控制在pH6.5、发酵温度在31℃、摇床转速约240 r/min、在175 mL/500 mL三角瓶中通气培养96h为最优培养条件。在上述条件下,摇瓶中发酵液的最大酶活力达0.49U/mL。为便于放大培养过程的计算机模拟和自动化控制,运用SAS及TableCurve 2D v5.01数据分析软件,建立了如下动力学模型。（1）.粉末几丁质浓度与细胞比生长速率关系的动力学模型: μ=0.1718S/[0.0495+S+（S²/1.0036）] （2）.粉末几丁质浓度与细胞生物量累积的动力学模型: Y=0.3822S/[0.0608+S+（S²/2.5929）] （3）.不同胶态几丁质浓度与细胞产几丁质酶累积的模型: H_CHI=0.2530S/（2.2669+S）

全文目录

1.前言  9-16
  1.1 几丁质及其应用  9-12
    1.1.1 理化性质  9
    1.1.2 几丁质及其衍生物的应用  9-12
      1.1.2.1 医药上的应用  9-11
      1.1.2.2 食品上的应用  11
      1.1.2.3 农业上的应用  11-12
      1.1.2.4 环保及其它领域的应用  12
  1.2 几丁质酶及其应用研究  12-16
    1.2.1 几丁质酶的种类  12-13
    1.2.2 几丁质酶的性质  13
    1.2.3 微生物几丁质酶  13-14
      1.2.3.1 产几丁质酶的陆地微生物  14
      1.2.3.2 产几丁质酶的海洋微生物  14
    1.2.4 微生物几丁质酶应用  14-16
      1.2.4.1 几丁质酶在生物防治中的作用  14-15
      1.2.4.2 几丁质酶在抗病基因工程中的应用  15-16
  1.3 本课题的研究意义  16
2.材料与方法  16-23
  2.1 材料  16-18
    2.1.1 培养基  16-18
    2.1.2 试剂与仪器  18
  2.2 方法  18-23
    2.2.1 胶体几丁质的制备  18-19
    2.2.2 DNS试剂的制备  19
    2.2.3 样品采集  19
      2.2.3.1 样品采集地  19
      2.2.3.2 样品种类  19
      2.2.3.3 采集方法  19
      2.2.3.4 样品处理方法  19
    2.2.4 菌的富集培养  19-20
    2.2.5 透明圈筛选法  20
      2.2.5.1 初筛  20
      2.2.5.2 复筛  20
    2.2.6 酶活力测定  20-21
      2.2.6.1 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的制作  20
      2.2.6.2 酶活力测定  20-21
    2.2.7 菌种保藏  21
    2.2.8 菌株鉴定  21-23
      2.2.8.1 形态特征  21
      2.2.8.2 生理生化特征  21
      2.2.8.3 16S rDNA序列的测定  21-23
        2.2.8.3.1 引物合成  21
        2.2.8.3.2 基因组DNA的制备  21-22
        2.2.8.3.3 PCR及其产物的回收和纯化  22
        2.2.8.3.4 转化  22-23
        2.2.8.3.5 重组质粒的鉴定  23
      2.2.8.4 16S rDNA的测序及序列分析  23
3.结果与分析  23-47
  3.1 菌株筛选的结果与分析  23-26
    3.1.1 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线  23-24
    3.1.2 细菌筛选结果  24-25
    3.1.3 放线菌筛选结果  25-26
    3.1.4 真菌筛选结果  26
  3.2 菌株鉴定的结果与分析  26-34
    3.2.1 0303菌株的鉴定结果  26-29
      3.2.1.1 0303的形态结构特征  26
      3.2.1.2 0303的生理生化特征  26-27
      3.2.1.3 0303的16S rDNA序列测定及亲缘关系分析  27-28
      3.2.1.4 0303的16S rRNA系统发育进化树的构建  28-29
    3.2.2 0318菌株的鉴定结果  29-32
      3.2.2.1 0318的形态结构特征  29-30
      3.2.2.2 0318的生理生化特征  30
      3.2.2.3 0318的16S rDNA序列测定及亲缘关系分析  30-31
      3.2.2.4 0318的16S rRNA系统发育进化树的构建  31-32
    3.2.3 0319菌株的鉴定结果  32-34
      3.2.3.1 0319的形态结构特征  32
      3.2.3.2 0319的生理生化特征  32
      3.2.3.3 0319的16S rDNA序列测定及亲缘关系分析  32-33
      3.2.3.4 0319的16S rRNA系统发育进化树的构建  33-34
  3.3 菌株0318产几丁质酶发酵工艺优化的结果与析  34-47
    3.3.1 不同浓度粉术几丁质对菌株生长代谢影响及其动力学模型  34-37
    3.3.2 不同碳源对产酶的影响  37-38
    3.3.3 不同浓度胶态几丁质对产酶影响及其动力学模型的建立  38-39
    3.3.4 不同氮源对产酶的影响  39-40
    3.3.5 不同浓度蛋白胨-NaNO_3对产酶影响  40-41
    3.3.6 不同浓度KH_2PO_4对产酶影响  41
    3.3.7 碳源、氮源和KH_2PO_4对产酶影响的正交实验  41-42
    3.3.8 NaCl浓度对产酶的影响  42-43
    3.3.9 培养温度对产酶的影响  43-44
    3.3.10 pH对产酶的影响  44
    3.3.11 发酵时间对产酶的影响  44-45
    3.3.12 接种量对产酶的影响  45-46
    3.3.13 种龄对产酶的影响  46
    3.3.14 摇瓶装液量对产酶的影响  46-47
    3.3.15 转速对产酶的影响  47
4.讨论  47-52
  4.1 海洋产几丁质酶菌株的筛选  47-48
  4.2 海洋产几丁质酶菌株的鉴定  48-50
  4.3 0318菌株产几丁质酶发酵工艺的优化  50-52
5.结论  52-53
参考文献  53-58
缩略语  58-59
附录  59-65
致谢  65

海洋产几丁质酶菌株的筛选、鉴定与发酵工艺的优化

内容摘要

全文目录

相似论文