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橡胶树胶乳中膜结合型焦磷酸酶基因的克隆和表达研究

作　者: 李小园
导　师: 校现周；曾日中
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 植物学
关键词: 巴西橡胶树 焦磷酸酶 cDNA克隆 基因表达 酶活性
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


植物组织中有两种类型的焦磷酸酶(pyrophosphatase PPase),一类是细胞质中可溶性的无机焦磷酸酶(inorganic PPase),另一类是与细胞液泡膜结合的不可溶性焦磷酸酶(vacuolar PPase,V-PPase)。后者除了水解焦磷酸(PPi)外,还具有质子泵的功能。 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管中V-PPase是调控橡胶生物合成的一个关键酶。它结合于黄色体膜上,除了降解橡胶生物合成过程中产生的PPi之外,还与ATPase协同作用,构成一个完整的质子泵体系,维持黄色体的稳态,调节细胞内的酸碱度,使胶乳中inorganic PPase处于最适的生理环境,及时地催化降解乳管中过多的PPi,从而保证橡胶生物合成能顺利地进行。 为了研究橡胶树胶乳中V-PPase基因表达的分子调控机理,本研究首先利用简并引物,扩增到胶乳中V-PPase基因的一个cDNA片段。然后运用RACE技术,在该cDNA片段的基础上得到了橡胶树胶乳V-PPase基因的全长cDNA序列(已提交GENEBANK,登录号:AY514019)。V-PPase基因可读框(ORF)全长2307bp,编码一分子量约为84.7kDa的769AA的酶蛋白。Northern杂交结果显示,外源茉莉酸(JA)处理橡胶树割面后2天内,胶乳中V-PPase基因的mRNA含量和对照无明显差别,2天后其含量开始逐渐升高,并在第6天达到最大值。外源乙烯(ET)处理橡胶树割面2天后,胶乳中V-PPase基因的转录水平开始升高,第4天达到最大值,并将持续保持至第8天,然后转录水平有所回落,并于第10天下降至原有的对照水平。 本研究还测定了外源JA和ET对胶乳V-PPase酶活性的影响。结果表明,(1)外源JA处理橡胶树割面8小时候后,胶乳中V-PPase的酶活性显著升高,并在第4天达到最大值,此后开始逐步回落,但与对照相比,酶活性仍然保持在较高的水平;(2)外源ET处理橡胶树割面后,胶乳中V-PPase的酶活性有所升高,但升高的趋势和幅度不如外源JA诱导的明显。 应用PET-EP原核表达系统,表达了橡胶树胶乳V-PPase基因可读框(ORF)中的一段cDNA序列,得到了分子量约为32kD的蛋白产物,为制备胶乳V-PPase的抗体和开展V-PPase的组织化学定位等后期研究工作奠定了基础。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
1 前言  9-21
  1.1 植物焦磷酸酶(PPASE)的研究进展  9-15
    1.1.1 巴西橡胶树中PPASE的研究进展  9-10
      1.1.1.1 巴西橡胶树中PPase的种类及其在橡胶合成中的调控作用  9-10
      1.1.1.2 巴西橡胶树中PPASE的分子生物学研究情况  10
    1.1.2 其它植物中PPASE的研究进展  10-13
      1.1.2.1 结构及其生理功能  10-12
        1.1.2.1.1 PPase的结构  11-12
        1.1.2.1.2 PPase的生理功能  12
      1.1.2.2 其它植物中PPase的分子生物学研究进展  12-13
    1.1.3 PPASE酶蛋白分离及纯化技术  13-15
      1.1.3.1 无机PPASE酶蛋白分离及纯化  13
      1.1.3.2 V-PPASE酶蛋白分离及纯化  13-15
        1.1.3.2.1 膜制剂的制备  14
        1.1.3.2.2 从膜制剂中纯化V-PPASE酶蛋白  14-15
  1.2 巴西橡胶树(HEVEABRASILIENSIS)的分子生物学研究进展  15-18
    1.2.1 橡胶延长因子(REF)  15-16
    1.2.2 3-羟基3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶  16
    1.2.3 含锰的超氧化物歧化酶(MNSOD)  16-17
    1.2.4 法尼磷酸合成酶  17
    1.2.5 巴西橡胶树死皮病相关基因  17-18
  1.3 RACE克隆的原理及其优点  18-21
    1.3.1 3′RACE克隆的原理  18-19
    1.3.2 5′RACE克隆的原理  19-20
    1.3.3 与几种常见克隆技术相比，RACE克隆技术的优势  20-21
2 材料与方法  21-38
  2.1 试验材料及处理  21
  2.2 菌种  21
  2.3 生化试剂  21
  2.4 实验方法  21-38
    2.4.1 橡胶胶乳总RNA的提取  21-23
    2.4.2 焦磷酸酶(V-PPase)基因部分序列的克隆(EST克隆)  23-27
      2.4.2.1 引物设计  23
      2.4.2.2 反转录扩增(RT-PCR)  23-24
      2.4.2.3 PCR产物的凝胶电泳观察  24
      2.4.2.4 PCR产物的回收  24
      2.4.2.5 PCR目的片段的克隆及重组子筛选  24-27
      2.4.2.6 重组子菌种的保存  27
    2.4.3 焦磷酸酶(V-PPase)基因的5′ RACE克隆  27-28
      2.4.3.1 引物设计  27
      2.4.3.2 5′ RACE-Ready cDNA的合成  27-28
      2.4.3.3 5′ RACE的PCR扩增  28
    2.4.4 焦磷酸酶(V-PPase)的3′RACE克隆  28-29
      2.4.4.1 引物设计  28
      2.4.4.2 3′ RACE-Ready cDNA的合成  28-29
      2.4.4.3 3′RACE的PCR扩增  29
    2.4.5 NORTHERN杂交  29-32
      2.4.5.1 探针的制备  29-30
      2.4.5.2 橡胶胶乳总RNA的提取  30
      2.4.5.3 RNA的印迹转移  30-32
        2.4.5.3.1 电泳系统等实验用具的预处理  30
        2.4.5.3.2 RNA的甲醛变性电泳  30
        2.4.5.3.3 RNA的印迹转移  30-32
          2.4.5.3.3.1 甲醛变性胶的处理  30-31
          2.4.5.3.3.2 尼龙膜的处理  31-32
      2.4.5.4 杂交  32
        2.4.5.4.1 预杂交  32
        2.4.5.4.2 探针杂交  32
      2.4.5.5 洗膜和检测  32
    2.4.6 胶乳中焦磷酸酶(PPASE)活性的测定  32-33
      2.4.6.1 样品的采集  32
      2.4.6.2 粗酶液的获得  32
      2.4.6.3 底物的配置  32-33
      2.4.6.4 PPase酶活测定的酶促反应  33
      2.4.6.5 酶促反应后无机磷释(Pi)放量的测定  33
      2.4.6.6 酶活性单位的定义  33
      2.4.6.7 C—乳清蛋白质含量的测定  33
    2.4.7 焦磷酸酶(V-PPASE)基因的原核表达  33-38
      2.4.7.1 表达引物的设计  33-34
      2.4.7.2 表达片段的PCR扩增  34
      2.4.7.3 表达目的片段和载体的制备  34-35
      2.4.7.4 原核表达载体的构建  35-36
      2.4.7.5 诱导表达  36-37
      2.4.7.6 PET-EP原核表达蛋白的提取和SDS—PAGE电泳鉴定  37-38
3 结果和分析  38-52
  3.1 胶乳总RNA的提取  38
  3.2 焦磷酸酶(V-PPASE)基因的EST克隆  38-40
    3.2.1 焦磷酸酶(V-PPase)EST的PCR扩增及阳性重组子的筛选  38-39
    3.2.2 焦磷酸酶(V-PPase)基因的EST克隆测序及序列分析  39-40
  3.3 焦磷酸酶(V-PPase)基因的5′ RACE克隆  40-41
  3.4 焦磷酸酶(V-PPase)基因的3′ RACE克隆  41-42
  3.5 焦磷酸酶(V-PPase)基因全长cDNA克隆的获得  42-45
  3.6 V-PPASE酶蛋白结构预测分析  45-46
  3.7 NORTHERN杂交结果与分析  46-47
    3.7.1 用于Northern杂交印迹转移的胶乳总RNA的电泳检测  46-47
    3.7.2 Northern杂交信号的检测结果  47
      3.7.2.1 JA处理的各样品的Northern杂交结果  47
      3.7.2.2 ET处理的各样品的Northern杂交结果  47
  3.8 胶乳中焦磷酸酶(PPASE)活性的测定结果与分析  47-49
    3.8.1 外源JA和ET处理后，胶乳中V-PPase酶活性的变化  47-48
    3.8.2 外源JA和ET处理后，inorganic PPase酶活性的变化  48-49
  3.9 V-PPASE基因原核表达结果与分析  49-50
    3.9.1 原核表达载体的构建  49-50
    3.9.2 原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳  50
  3.10 本研究中所用到的部分试剂及其配方  50-52
4 结论和讨论  52-54
  4.1 结论  52
  4.2 讨论  52-54
3.结束语：  54-56
附录一 缩略词表  56-57
附录二 DNA测序图谱  57-60
附录三 酶活测定数据分析的部分SAS程序  60-62
参考文献  62-68
致谢  68

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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