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新型NK细胞抑制性受体KLRL1的基因克隆与功能研究

作　者: 韩岩梅
导　师: 曹雪涛
学　校: 第二军医大学
专　业: 免疫学
关键词: NK cell C-type lectin-like domain killer cell receptor cytotoxicity immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM)
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

自然杀伤细胞(natural killer，NK)无需抗原预先作用就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，因为具备此功能特点，NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。NK细胞表面分布杀伤活化受体和杀伤抑制受体，通过两种受体的相互作用确保NK细胞既能杀伤病毒感染的细胞和突变肿瘤细胞，又能保护宿主自身正常细胞免遭破坏。NK细胞表面杀伤抑制受体与靶细胞表面组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ类分子)结合，可产生杀伤抑制信号，能阻断杀伤信号的传递。对于宿主自身组织细胞，因MHCⅠ类分子表达正常使杀伤抑制受体介导的抑制作用占主导地位，表现为NK细胞失活；对于病毒感染的细胞和肿瘤细胞，由于MHCⅠ类分子表达减少或缺失而影响杀伤抑制受体与相应配体的结合，从而使杀伤活化受体的作用占主导地位，表现为NK细胞活化并产生杀伤作用。近年来研究表明，人类细胞表面抑制性受体可以分为三个家族：第一个家族为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Ig-like Receptors KIR)，在结构上为胞外段有二到三个免疫球蛋白样结构域的一型膜蛋白受体，配体为人类白细胞抗原Ⅰ类分子(HLAⅠ类分子)；第二个家族为免疫球蛋白样转录产物(ILT)，包括ILT-4、ILT-2等；第三个家族为杀伤细胞凝集素样受体(Killer cell Lectin-like Receptors KLR)，所有成员定位于12号染色体的NK复合体(NKC)，包括CD94／NKG2、NKR-P1A、KLRF1、CD69、CLEC-2等。免疫抑制性受体的结构特点为胞内段含有一个或多个免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)，ITIM是由6个氨基酸组成的保守序列(I/L/VXYXXL/V，X代表任一氨基酸)。当免疫抑制性受体与相应配体偶联时，ITIM发生酪氨酸磷酸化，然后与SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶或／和SPIP肌醇磷酸酶的结合，产生细胞活化的负调节效应。由于免疫抑制性受体在细胞活性调节中发挥重要作用，尤其近年来发现这一类分子在杀伤性T淋巴细胞和树突状细胞(Dendritic cells，DC)表面均有表达，使其具有重要的理论探索意义和广阔第二军医大学硕士学位论文中文摘要的临床应用前景，是当前免疫学、细胞与分子生物学和肿瘤学等领域的热门课题。本研究的目的在于:(l)发现并克隆杀伤细胞凝集素样受体家族的新成员一新型抑制性受体KLRLI cDNA，明确其基因组结构并进行染色体定位;(2)明确KLRLI的组织分布和在各种免疫细胞中的表达调控模式，预测其功能;(3)对KLRLI进行原核和真核表达，研究其生物学性质;(4)以NK细胞为模型，初步探讨KLRLI的免疫学功能。本研究通过大规模随机基因测序从人DC的cDNA文库中获得一条含有C型凝集素样结构域(e一type leetin一like domain，CTLD)的新核昔酸序列(已在GenBank上登录，登录号为AF247788)。该片段长1566bp，包含一个完整的开放读框，预测编码区推导出的蛋白分子含265个氨基酸，该序列利用ANTHEPROT和BxPAsy分析软件进行分析显示，从第44位氨基酸到66位氨基酸是一个完整的跨膜区段，不含信号肤序列，胞内段起自氨基酸N端提示该蛋白是一n型跨膜分子;在细胞外区段，含有一个C型凝集素样结构域;在细胞内区段，有VT、rADL结构，它符合V/L/IxyxxL尸铲这一免疫受体中酪氨酸相关的抑制型基序ITIM;同源序列分析显示该序列与人C型凝集素样受体l(hCLECI)有51%的相似性，与人C型凝集素样受体2(h CLEC2)有47%的相似性，与人CD94有43%的相似性，根据该分子以上结构特征，我们认为其为杀伤细胞凝集素样受体家族中新的抑制性受体，将之命名为杀伤细胞凝集素样受体Ll(Killer eeULectin一like RecePtorLI，KL甩1)。然后根据拼接序列设计特异性引物，从人单核细胞来源的DC中克隆出全长cDNA。同时我们分别从Ge心如k小鼠和大鼠EST数据库中搜索到KLRLI的小鼠和大鼠同源分子(分别将其称为mKLRLI，rKLRLI)，登录号分别为NM一1 77686和XM--2 32420。同源序列分析显示mKLRLI与h KLRLI有65%的相似性，而rKLRLI与h KLRLI有70%的相似性。mKLRLI是一个由267个氨基酸组成的11型跨膜分子，其结构特征与h KLRLI相似。利用BlastN一htgs软件在基因数据库中搜索得到了KL甩1的染色体位置。 hKLRLI基因定位于人12号染色体短臂NK复合体编码区，与杀伤细胞凝集素样受体家族其他成员相邻。mKLRLI和rKLRLI分别由位于小鼠6号染色体和大鼠4号染色体NK复合体的基因编码。接着我们运用RT-PCR检测hKLRLI组织和细胞分布情况。结果显示hKLRLI仅在人脾脏、胰脏、胎盘、胸腺和外周第三军医人学硕_l:学位论文中文摘要血有不同程度的表达，其中在脾脏和外周血表达量最高，其它组织均不表达;此外，在所选择的部分造血细胞系和肿瘤细胞系中，hKLRLI仅在新鲜分离的DC、NK细胞、CDS+T细胞和单核细胞系(THP一z，U937)中表达，在CD4+T细胞、B细胞系(Raji，Ramos和oaudi细胞)和肿瘤细胞系(A431，A549和HeLa细胞)未检测到表达信号的存在。mKLRLI在小鼠脾脏、心脏、脑、肺、胸腺和外周血有不同程度的表达，其中在外周血表达量最高，其它组织均不表达;另外，mKLRLI在小鼠新鲜分离的DC、单核细胞系(J77

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-18
第一部分 KLRL1全长序列的克隆和分析  18-27
第二部分 KLRL1的组织分布、细胞表达和细胞定位研究  27-38
第三部分 KLRL1作为抑制性受体的相关功能研究  38-54
小结  54-56
参考文献  56-61
致谢  61-62
文献综述  62-76

新型NK细胞抑制性受体KLRL1的基因克隆与功能研究

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